8.1色谱辩析.pptVIP

生物工程分析与检测 第八章 色谱分析法第一节 概述 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 其它名称:层析法、色谱法、层离法等。 原理：利用混合物中组分的物理(大小、带电荷的多少) 化学(置换反应) 、生物学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两相中。 2.色谱的基本分类 层析形式：纸层析、气相色谱、高压液相色谱、薄层层析、亲和层析、凝胶层析、离子交换层析等。 色谱分析中的相：液相、气相、油相、水相。 固定相， 流动相 当流动相流过含有样品的固定相时，各组分以不同速度移动，从而达到互相分离。 固定相：可以是固体，也可以是以被固体或凝胶所支持的液体，可以装入柱中，也可以为薄层或薄膜。 流动相：液体，气体。 层析过程中包括吸附与分配平衡，溶解与析出等到平衡。 2. 层析法分类 按两相所处的状态分 液相色谱(含液液色谱、液固色谱) 气相色谱(含气液色谱、气固色谱) 按固定相使用形式分 柱层析 纸层析 薄层层析 按分离过程的原理分 分配层析 吸附层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 3. 色谱法的应用 1、分离混合物:一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。 2、精制提纯化合物 有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。 3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。 4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。 4. 不同色谱分析技术的原理 柱层析的传统分类： 吸附层析 分配层析 离子交换层析 亲和层析 凝胶层析 4.1.1原理 利用吸附剂(如氧化铝粉末)对不同物质吸附能力的差别达到分离的目的 解吸、吸附、再解吸、再吸附 4.1.2吸附剂 吸附剂需满足以下要求 具有合适的吸附力，表面积大，通常呈粉末或纤维状。(表面积越大，吸附能力越强，常用加热处理，除去吸附的水分) 吸附剂颗粒均匀，100-200目为宜 吸附剂与吸附物质的吸附、解吸可逆 吸附剂不应含有杂质，否则需用预处理后使用，通常用有机溶剂浸泡去除杂质 吸附剂材料 无机吸附剂：氧化铝、碳酸钙、氧化钙、氧化镁、氧化锌、磷酸氢钙、硅酸、活性炭等 有机吸附剂：蔗糖、乳糖、淀粉、菊根粉、纤维素等。 吸附剂的选择一般可以应用前人的经验或小样试验，常采用具有中等或较强吸附力的吸附剂。 4.1.3 洗脱剂 洗脱剂选择： 样品在溶剂中的溶解度 溶剂一般需无水溶剂，而且不与水互溶 溶剂的沸点要适宜，一般讲溶剂沸点以40-80℃为宜 溶剂纯度要高，溶剂中即使是微量杂质的存在，也可明显地改变吸附性质 溶剂的解吸能力适当，可采用按一定比例制备多元混合溶剂系统，以调整洗脱能力。 4.2 分配层析 分配层析是利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离，它相当于一种连续的溶剂抽提法。固定相为液体 4.2.1 分配系数K 一定量的溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂中的浓度比值为一常数，此常数称为分配系数。 固定相中溶质的浓度（克/升） 固定相中溶质的量 K= ———————————— = ——————— 流动相中溶质的浓度（克/升） 流动相中溶质的量 4.2.2 分配柱层析原理 移动速率R 色带中心（浓度中心）的移动速率 R= —————————————————— 柱层析上部洗脱剂上层液面的移动速率 色带中心（浓度中心）的移动距离 LA = ——————————————— = —— 洗脱剂上层液面的移动距离 LS 4.2.1 固定相与流动相 固定相：一般由支持剂和溶剂组成。 支持剂要求是化学惰性，没有吸附力，但能保留大量的固定相液体。常使用的支持剂有硅胶、硅藻土类、纤维素、淀粉等。固定相的液体通常是水溶液或与水混合的液体，常用的