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含RGD序列环肽的设计与合成方法研究 初虹，陆冬冬（苏州中科天马肽工程中心有限公司，苏州 215101） 摘 要：目的 介绍含RGD序列的环肽的设计与合成方法。方法 二硫键成环、酰氨键成环和click反应成环是含RGD序列环肽的主要成环方式。结果 三种方法应用越来越多，易于得到低消旋，高产率的产物。 结论 设计与合成有高稳定性和高生物活性的含RGD序列的环肽是含RGD类多肽研究的主要方向。 关键词：RGD序列;环肽;合成;Click化学反应 近些年，人们对含RGD序列的环肽及其类似物的研究越来越热。RGD序列即含有精氨酰-甘氨酰－天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的三肽序列，该三肽序列是细胞中粘附蛋白的功能序列，最初是在细胞外基质（简称ECM）中获得的。在细胞生长过程中正常细胞只有粘附于一定的基质才能生长，脱离了基质细胞生长就会很快停止于Gl期或 G0期。整合素(Integrin)即RGD受体的统称[1]，整合素介导着许多种类的细。细胞及细胞．底物间的相互作用，参与许多生物学过程。如体内平衡调节，细胞粘附，细胞迁移，细胞内信号传递过程，淋巴细胞识别，血小板的凝聚等。含RGD序列的粘附蛋白在细胞粘附中起重要作用[2]。药理学实验表明，许多含RGD序列的小分子片段可抑制细胞的粘附。许多病理学过程如血栓形成，肿瘤组织的转移等都与细胞粘附作用有关。因此RGD类多肽的粘附性成为药物设计的新靶点，含RGD序列的多肽或化合物有望治疗一些与细胞粘附作用相关的疾病。 很多线性肽在体外具有较好的生物活性和稳定性，但由于体内存在各种各样的酶，这些酶的存在会破坏活性肽的结构，从而导致其在体内半衰期短，生物利用度低。对于需要大量用药的治疗方案来说，无疑会大大增加医疗费用，并可能导致意想不到的治疗风险。因此，增加肽类化合物的稳定性，提高肽的生物活性和生物利用度是很多药学工作者所努力的方向。除了改变多肽类药物的剂型，从而延长其半衰期，增强其抗酶解能力外，将肽链的主体或部分设计为环形结构，也是增加多肽生物稳定性的有效方法之一，并且有大量的科学实验已证明了这一点。笔者在平时的工作中也遇到过很多含RGD序列的环肽，现对含RGD序列的不同环肽的合成方法在这作一概述。 1 通过二硫键成环的含RGD序列的环肽 由于Cys的侧链-SH易于氧化成S-S键，因此可采用此特性将线性肽氧化成环肽。笔者在平时的实验中也遇到很多通过二硫键成环的含RGD序列的环肽，其通式为-X1c(CRGDC)X2-。合成的思路一般是先用固相法合成线性肽树脂，采用缩合剂DIC/HOBt,HBTU/HOBt/NMMM或PyBOp/HOBt/NMM等，然后采用液相氧化。二硫键的形成也可以通过固相氧化如I2,K3Fe(CN)6，空气，Tl(tfa)3等，但固相法氧化中间过程不容易控制，氧化条件难以掌握，所以一般采用液相氧化，可以通过HPLC随时跟踪检测。液相氧化时多肽浓度一般在0.1～0.5mg/ml,可通过空气氧化[4]，将脱保护游离出半胱氨酸-SH的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性(PH6.5～10)，在空气中搅拌自然氧化，时间一般需要24h以上。此法的有点是：副产物为水，纯化方便。缺点是氧化时间长且很难氧化彻底。H2O2氧化因具有副产物为水，氧化迅速，纯化方便等优点，因此是我们用的最多的一种氧化方法。氧化前将粗肽用水溶解完全，可加适量DMSO,醋酸等助溶。用氨水或NaHCO3调pH到7.2～7.4之间，加10～20倍量左右的10％H2O2，反应一般在30min～2h,用HPLC跟踪检测氧化是否完全。氧化完全后用醋酸调PH值到4～5左右，加少量Vc防止过氧化。文献中报道液相中氧化二硫键还可以用20%DMSO水溶液氧化，反应1～4h,可在PH3～8范围内适用，对碱性或疏水性的肽尤其适用。除此之外，还可用I2,K3Fe(CN)6，N-碘代琥珀酰亚胺（NIS)氧化，氰化碘（ICN）,锍盐氧化，Npys氧化法，都有相应的环化实例。 2 通过酰胺键成环的含RGD序列的环肽 关于环肽的合成有很多的文献报道，从成环方式上可分为三种方式[5]：（1）头尾成环脱去N 端保护, 游离的氨基进攻肽链的C 末端。（2）侧链-侧链成环, 即侧链的氨基(如Lys , Orn) 与侧链的羧基(如Asp , Glu) 成环。(3) 侧链有羧基的氨基酸与N端成环。从合成方法上又可分为溶液合成法和固相合成法两种[6]，溶液合成法是在高度稀释的溶液中进行的（一般为10-3～10-4mol/L）,将裂解下来的线性肽在缩合剂的加入下成环，也可先将C端活化再成环。C末端活化的方法有活泼酯法，叠氮法，硫酯法或加入辅助试剂成环。固相法成环是在树脂上成环，然后脱落下来，避免了分子间的聚合。据文献报道常用的树脂