拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应分解.pptVIP

拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应 符晓婕 摘要 植物漆酶基因家族在拟南芥中共有17个成员, 目前各基因的具体功能尚不十分清楚。该研究利用过量表达的方法初步分析了拟南芥AtLAC4的功能。 GUS染色显示AtLAC4在拟南芥的维管组织中有较强的表达, 并在叶片排水器中特异表达。 AtLAC4过量表达导致植株木质素含量增多、次生壁加厚、植株变小和莲座叶叶柄变短。 ABA对AtLAC4的表达具有明显的诱导作用, AtLAC4过量表达植株对外源ABA敏感; 干旱处理后,AtLAC4过量表达植株的耐旱能力比野生型明显增强。 漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶, 最早是从漆树(Rhus venicifera)的分泌物中发现的。按其来源主要分为植物漆酶(Rhus Laccase)和真菌漆酶(Fungal Laccase)两大类。 植物漆酶一般是由约500个氨基酸的单一多肽组成。Cu2+以配位键与特定的氨基酸相连, 并处于漆酶的活性部位, 在漆酶的催化氧化过程中起决定作用。 作为多酚氧化酶家族的漆酶还能够使酚类化合物聚合, 参与对伤害的防御反应, 使植物免受昆虫和病原体的侵袭。拟南芥中漆酶基因家族共有17个成员。McCaig等运用构建系统进化树等生物信息学方法将此17个基因归类至6个漆酶亚家族中。 关于漆酶家族成员生物学功能的研究则报道较少。Zhou和Berthet等对拟南芥的研究发现, AtLAC4 可能在木质素及植物次生壁合成过程中起重要作用。但是其在植物生长发育中的具体生物学功能尚不十分清楚, 需要更多的实验数据来阐明。 本文主要以过量表达AtLAC4 植株和AtLAC4 启动子与β-glucuronidase(GUS)报告基因融合表达植株为材料, 研究在植物生长发育过程中和响应外界环境时该基因的功能, 为AtLAC4基因及植物漆酶基因家族的功能研究提供证据。 1.1 植物材料与处理 拟南芥种子先经70%乙醇表面消毒30秒, 之后加入10%次氯酸钠消毒10分钟, 无菌水冲洗4–5次后均匀播种于MS平板上。4°C保湿黑暗冷藏3天打破休眠, 之后移至拟南芥培养室中培养。10天后移至土壤中生长, 培养温度为(22±2)°C, 光暗周期为16小时光照/8小时黑暗, 光照强度为120–150 μmol·m–2·s–1。 取MS培养基上生长14天的野生型拟南芥, 分别用无菌水、100 μmol·L–1赤霉素、100 μmol·L–1萘乙酸、100 μmol·L–1脱落酸、1 mmol·L–1水杨酸、30mmol·L–1蔗糖、15%聚乙二醇、5 μmol·L–1 CuSO4以及4°C处理3个小时, 然后取样, 用于提取RNA进行基因表达检测。 以野生型为对照, 观察各转基因植株及突变体在不同生长发育时期的生长状况, 拍照并测定相关数据。种子萌发以胚根突破种皮为标准. 叶柄长度统计时,分别取16株野生型35S:AtLAC4植株的第5–10片莲座叶进行测定。取生长20天左右的野生型和过量表达植物进行干旱胁迫处理, 连续处理10天和20天后进行表型观察。所有表型分析实验均在相同条件下重复进行3次。 1.2 转基因拟南芥的获得 GUS基因的植物表达载体为pCAMBIA1303, 利用5-ACTGAGCTCACCATAGTTTTCATTGGAC-3′和5-ATACCATGGCTCCCTCTCTATCTTTCTC-3′从植物基因组DNA中扩增AtLAC4的启动子序列; 测序正确后, 利用SacI和NcoI将启动子构建到GUS植物表达载体中。过量表达载体为改造过的pCAMBIA-1390 。 利用引物5′AGTTCTAGAATGGGGTCTCATATGGTTTG-3′ 和5′-ATTGGATCCTTAGCACTTGGGAAGATC-3′将AtLAC4基因的CDS连接到T载体上; 测序正确后, 利用XbaI和BamHI将CDS连接到植物过量表达载体中。分别以pCAMB- IA1303和改造过的pCAMBIA1390质粒为对照, 用连接成功的植物表达载体质粒转化农杆菌LBA4404, 并用花粉管浸染法转化拟南芥, 潮霉素筛选转基因植株并进行PCR检测, 选取单位点插入的纯合转基因株系用于后续实验。 1.3 半定量RT-PCR 利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA后, 用DNAaseI (Takara)处理以消除基因组DNA的污染。定量后, 吸取等量的RNA并用PrimeScriptTM反转录试剂盒(Takara)进行cDNA第1链的合成; 再吸取等量的cDNA为模板进行PCR反应, 进行26个循环。取15μLPCR产物进行电泳检测。 检测目的基因AtLAC4的引物为5′TCATCGTTCTAGGTGAATGG