层析法-理论专用课件.pptVIP

* * * * * 如硅胶在吸水量达70％以后其吸附能力消失，变为载水的载体，水即为固定相 * * 多种别名 * * 凝胶层析用于分离目的时有两种：一是组别分离，这种情况下，混合物中各组分的相对分子质量差别较大，常用于制备性分离；二是分级分离，指相对分子质量比较接近的物质之间的分离，分辨率比组别分离高，常用于分析。 * * * * 能与生物高分子进行专一性可逆结合的物质叫配体 离子交换分离操作技术 树脂的选择和处理 装柱 交换 洗脱 树脂再生 离子交换树脂 玻璃纤维 交换柱 离子交换层析 离子交换剂的优点： （1）不溶性的高分子聚合物，具有立体网状结构，有较好的化学稳定性。 （2）交换剂本身吸附能力弱，引入的可以发生电离的活性基团。 （3）多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。 C O O H C H 2 C H O H C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 3 C H C H 3 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 3 C H C H 2 C H C H 2 H 2 S O 4 S O 3 H S O 3 H S O 3 H S O 3 H S O 3 H S O 3 H + H C = C H H C = C H H C = C H （ 催 化 剂 ） n （ 分 散 剂 ） \ \ \ \ \ \ 阳离子交换分离（0.1mol·L-1 HCl为淋洗液） 0 100 200 300 400 V洗(mL) c Li+ Na+ K+(2mol·L-1 HCl) K+ 亲和力大的先被交换上去, 后被洗脱下来. 树脂类型 阳离子交换树脂: 含酸性活性基团的树脂。 强酸型： R—SO3H pH 0-14 不受酸度限制 交换 洗脱 弱酸型：R—COOH pH4 R—OH pH9.5 选择性好, 可分离各种有机碱及氨基酸 强碱型： R —N(CH3)3Cl pH 0-14 弱碱型： R —NH2 ， R—NHCH3 pH 0-7 R—N(CH3)2 pH 9.5 螯合树脂：含有特殊的螯合活性基团 交换 洗脱 水化作用 阴离子交换树脂: 含碱性活性基团的树脂 树脂对离子的亲和力顺序 强酸型阳离子交换树脂 对一价阳离子 Li+ H+ Na+ NH4+ K+ Rb+ Cs+ Ag+ Tl+ 对二价阳离子 Mg2+ Ca2+ Sr2+ Ba2+ Fe2+ Co2+ Ni2 +Cu2+ Zn2+ 水合离子半径越小亲和力越大 强碱型阴离子交换树脂 F- OH- Ac- HCOO- H2PO4- Cl- NO3- HSO4- CrO42- SO42- 对不同价态离子 Na+ Ca2+ Fe3+ Th4+ 电荷数越高亲和力越大 四、凝胶层析（Gel chromatography） 凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 主要用于大分子物质的分离。 凝胶的种类和性质 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex) 琼脂糖凝胶 (Sepharose) 聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel P) 分子筛效应 凝胶层析示意图 凝胶层析 分子筛效应 全排阻：分子直径比凝胶最大孔隙直径大，全部被排阻在凝胶颗粒之外 另外，直径比凝胶最小孔隙直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。 凝胶层析的应用 1、分离提纯蛋白质、核酸等生物大分子(脱盐) 2、酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离精制 3、测定高分子物质的分子量 4、高分子溶液的浓缩 层析柱的重要参数 柱体积Vt：凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。 Vt = 1/4 πd2h 外水体积V0：层析柱内凝胶颗粒间隙的总容积。 层析柱的重要参数 内水体积Vi：凝胶颗粒内部微孔的总容积。 Vi = W（凝胶干重）·Wr（吸水值） 凝胶颗粒基质所占的容积Vr 峰洗脱体积V