雪松病原培养实验报告.docVIP

陵川雪松病害病原培养实验报告 雪松为松科常绿乔木，是世界三大著名观赏树种之一。由于雪松适应性强，病虫害少，树形优美，常作为城市庭园和道路绿化树种。 雪松很少发生病害，目前国内报道有以下几种：（1）假蜜环菌引起的根朽病。（2）异担孔菌引起的针叶树根白腐病。（3）蛛形葡萄孢菌引起的雪松枯梢病。（4）松球壳孢菌引起的雪松梢枝病。（5）聚生小穴壳菌引起的雪松溃疡病（6）樟疫霉菌、掘氏疫霉菌和寄生疫霉菌引起的雪松疫病，主要症状为根腐、溃疡、猝倒和立枯，造成植株直立枯死。（7）葡萄孢菌引起的雪松灰霉病，造成嫩梢发生溃疡、枯梢及小枝枝枯。（摘自雪松针叶枯斑病病原鉴定及其生物学特性研究）。以上病害除蛛形葡萄孢菌和松球壳孢菌引起雪松枝梢枯死外，其他5种病害分别危害根茎和干部皮层。引起雪松针叶病害的报道较少,有过报道的有雪松落叶病和雪松赤枯病。 雪松落叶病（松针枯病）是下部的针叶先出现症状，逐渐向上蔓延，严重时全株干枯死亡，受害的针叶从尖端开始一段一段的发黄；以后逐渐变深褐色。 雪松赤枯病症状为松针受害后先出现黄色段斑，渐变褐，最后呈灰白色或暗灰色，稍凹陷的病斑。病斑与健康组织交界处常有1暗红色的环圈，病部散生黑色小点，即病菌的分生孢子盘，以叶尖枯死为主。 我们将发病叶片采集回来发现，病叶表面散生有黑色小点，叶尖变白枯死，病斑与健康组织交界处有暗红色的环圈，我们初步鉴定为此病为雪松赤枯病。为了更进一步的证明此病的病原，来更有力的鉴定此病害，我们对此做了病原培养实验。 一、病原菌的分离纯化 1.组织培养：取新鲜雪松病叶用无菌水清洗晾干后，剪取病健交界处组织，大小约3mm左右，在超净工作台内，用75%的酒精消毒1min，用无菌水冲洗3次，用灭菌的滤纸吸干水分，接种到PDA培养基上，在每皿中央放置4～5块，置于25℃恒温培养箱中培养。 培养7天后可以看到菌落中心发黑，边缘发白，可以初步判断为此病有真菌侵染。 2、病原镜检 将培养7天后的菌落，用已用酒精灯灭菌的挑针挑取一小块黑白交界处的菌块，放置于用75%的酒精消毒的载玻片上，在光学显微镜下进行镜检。（除了菌落，所有的器具均在超净台紫外灭菌15分钟以上，整个操作在超净台完成） 从图中可以看到雪松病叶中有真菌侵染，此病原分生孢子为链格孢属，和去年引起水杉赤枯病的病原一样。为了证明此病就是这种病原侵染所致，我们必须再做病原菌的纯化和健康雪松叶子接种实验。 3、病原菌的分离纯化 （1）分离纯化 将培养7天后形成的菌落，用挑针挑取菌落边缘的新鲜菌丝，转到新新鲜的PDA培养基上进行纯化培养。 单孢分离： 将已纯化培养7天后的菌落，待产孢后向平板中加入灭菌水轻微晃动，进行梯度稀释，至一滴水中含有1～2个分生孢子为最佳。将适宜浓度的孢子悬浮液涂布于水琼脂上，24h后置于显微镜下观察，用接种针含有单孢子的培养基移入新的PDA培养基上，25℃培养7天，长出的菌落即为水杉病原菌的纯培养物。 通过对其单个分生孢子的形态观察，我们鉴定此分生孢子为半知菌链格孢属，顶端产生倒棍棒形、椭圆形或卵圆形的分生孢子。 二、接种实验 根据柯赫氏法则，要将分离纯化的病原菌接种到健康的雪松叶子上，如果症状相同，才可判断引起该病的就是此病原。 接种体的制备：在纯培养物上喷洒无菌水，配置孢子悬浮液，进行梯度稀释直至一滴水中含有1-2个分生孢子最佳。 接种：将配好的孢子悬浮液喷洒于已用75%酒精消毒的健康的雪松叶片上，以一小枝为一个处理，放置于覆盖有两层滤纸的培养皿上进行保湿培养（喷雾不可过多、过湿）。对照用无菌水进行喷雾，置于25℃培养箱中培养，每天观察病叶发病情况。 接种四天后 通过培养实验后，接种的健康叶片4天后出现叶片发黄变褐，而未接种的没有这种症状，说明此病为此病原菌侵染所致，此病为雪松赤枯病。 图2. 叶尖发白症状 图1. 病叶黑点症状 图3. 病叶接种7天后的菌落形态。A、B为不同视野 B A B A 图4. 光学显微镜下的病原菌分生孢子。A、B为不同视角 图5. 梯度稀释后显微镜镜检下的单个孢子 图6. 刚接种完接种与未接种的健康雪松叶子 图7.接种4天后图片。A为感病叶片，B为对照。 A B