石蜡切片的制作题材.pptVIP

石蜡切片的制作 植物制片的基本步骤 1、取材 2、杀死、固定、保存 3、脱水、置换 4、渗透、包埋 5、切片、粘片 6、染色、封固 需要时间长（十几天），但可长期保存。 1.取材 材料来源及部位。 ①种类： ②部位： ③年龄或发育阶段 ④是观察横切面还是纵切面？ 取材原则： 动作------快，轻，用力均匀 体积合适 刀要锋利 2.固定 目的---保持原来的结构 固定液 固定时间 固定后的处理 混合固定剂 固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。 F.A.A固定液 最常用的固定液。固定时间，不受限制，短为24小时，长可延至数月或数年。 [配法]－－－－50％或70％酒精－－90毫升冰醋酸 －－－－－－5毫升福尔马林－－－－－ 5毫升柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制。 卡诺氏(Carnoy‘s)固定液 有极快的渗透力， 固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不能超一天)。 固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70％酒精中保存。配法有两种： 4% 多聚甲醛 ---0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）配制 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，继续浸泡固定2～24h（4度）。 另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。　　 配制方法 称取40g多聚甲醛，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1M NaOH才能使溶液清亮，最后定容1000ml，充分混匀。 固定组织时应注意： ①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。 ②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。 ③固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。 (4) 抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰 固定时间的选择 不同的固定液。 材料的大小，组织的特性与致密度。 温度的不同。 组织固定后的处理 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 修块:大小合适、去除形态不好的部分， 材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。 通常在4度冰箱中存放。 3.洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行. 30%--50%---70%---85%---95%--100%--- 100% 每步30-60分钟左右。 要求及注意： 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净， 不同大小的组织块脱水时间不同。 不能过度脱水（过久使组织变脆, 收缩） 在酒精中加入曙红，用于染色。 材料可以放在70％酒精中保存， 正丁醇、叔丁醇、丙酮等也可做脱水剂。 4.透明 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。 通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。 材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。 透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。 如果透明时间过短或者过长，都不合适。 5.浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时或者过夜，再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天 浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。 石蜡的处理： 新蜡应溶一次，增加密度。 并用滤纸过滤去处杂质。 加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。 反复溶的旧蜡包埋效果更好。 如果将2-3种不同熔点的石蜡混合使用效果好。 程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中1次，在石蜡中2次，每次1-3天左右。 包埋：在室温进行 6.切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，附于小木块上， 切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。 通常切片厚度为8～12微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔