计算机在生命科学的中应用第四次作业.docVIP

对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 实验目的：1.利用软件Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌DNA序列进行酶切找到含目的基因的比较小的片段 2. 利用软件Vector NTI Explore进行引物设计引物 实验材料：Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段DNA 序列。 实验原理： 1. 引物设计的原则： A 长度在18~35bp，GC含量在40%~60%之间，内部无发卡结构，Tm值最好接近72℃； B 引物之间避免形成二聚体； C 引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； D 在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。 E. 引物3′端不能选择A，最好选择T。 F. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等 实验内容： 试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中80-709bp是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用Vector NTI Explorer分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段，最后得到1——1429的DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计 9的PCR引物，使用PCR扩增得到目的DNA。 1, 首先我们要用限制性内切酶将冗余的片段切去。找目的基因所在的片段 这是Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA序列利用软件Vector NTI所能找到的所有酶切位点： 因为该物种中限制性内切酶PstI 只有一个切点，且位于3370bp处，可以一次性出去一大段多余的部分，所以先用PstI酶切并进行电泳，选择琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图： ， 同理， 我们将 1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是我们需要的含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图9所示。用工具找它的ORF，ORF的分析结80~709bp处， 1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATT TTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101 GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAAT CCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201 ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAA TATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTT AvaI ~~~~~~~ 301 GGTAAAAGGG GGTTATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTACAA TTTCAGGATA TATACTCTCG AGCAGTAATA TATTAGAATA TAGA