感受态细胞制备实验原理及过程.doc

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2017-02-12 发布于重庆
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感受态细胞制备实验原理及过程

感受态细胞的制备及质粒DNA导入宿主菌实验原理及过程实验步骤实验原理1 挑取一个单菌落于mlSOB(无抗生素)培养基中，37，10rpm培养让菌复苏，进入对数的早中期取培养物加入到mL SOB (无抗生素)培养基中，rpm过夜培养减少达到所需的所需繁殖的世代数，以减少菌的变异取培养物置于0mL的灭菌离心管中，冰浴10，rpm，4℃离心10，弃上清使细菌的生长停止，代谢减慢菌体重悬于mL冰冷中防止细胞裂致大量细胞死亡菌体重悬于1mL冰冷中除去所有的以及细胞破损后释放出来的细胞内含物 DMSO为抗冻剂，但会降低转化率 7 将悬浮液等份（50ul）分装到无菌的离心管中，液氮中速冻低温对大肠杆菌保存有利，温度越低保存时间越久 8 取感受态细胞冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡 A：加入2uLpETa(+)质粒，冰浴30 min受体菌加入2uL无菌双蒸水阴性对照阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性热激 42，90冰浴2 min在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内加入800uL无抗生素的，37复苏用复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长取ul, 50ul细胞直接在含50ug/mL的LB培养基上铺平板倒置平皿37培养过夜，出现菌落因为抗生素高温易失活，所以应等到热而不烫加入抗生素这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。这是因为的菌落的抗性基因菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落