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慢病毒载体介导的基因治疗在骨缺损修复中的研究进展 2014-10-12?发表评论?分享 骨缺损、骨坏死是临床上困扰医生的一大难题，也是修骨再生领域研究的热点。随着转基因技术和干细胞技术的不断发展，基因治疗手段在骨缺损修复再生领域展现出无可比拟的优势和广阔的应用前景。 基于人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV－1)的慢病毒载体以转染效率高、可持续稳定表达外源基因、增加调控基因后可调控目的蛋白的表达量、容纳大片段(8－10kb)的外源性目的基因和安全性高等优点，近年来已经越来越多的应用于骨缺损修复和再生领域并取得了很好的效果。本文就慢病毒载体的生物学特点及骨缺损治疗应用方面作简要综述。 慢病毒载体的生物学特点 慢病毒属于逆转录病毒科，其核心为二倍体的单股正链ＲNA病毒。总的来说慢病毒载体包含有包装成分和载体成分两种成分，前者通过翻译能提供生产病毒颗粒所需的蛋白质，而后者则含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件，可在此位点插入外源性目的基因。构建好的慢病毒载体转染到宿主细胞体内后，在逆转录酶作用下以自身ＲNA序列为模板合成cDNA，接着自身复制合成双链DNA，最终在自身合成病毒整合酶作用下嵌入到宿主染色体中，如此可随着宿主的复制而传代，从而长期、稳定地表达目的蛋白。 慢病毒的结构 慢病毒有许多种类，HIV－1型慢病毒由于其分子生物学、病理药理学等方面已有非常深入的研究，在临床和实验室研究的应用最广。HIV－1基因组的主要结构为gag、pol、env3个结构基因，它们分别编码病毒核心蛋白(核衣壳蛋白、基质蛋白、衣壳蛋白)、病毒复制所需酶类(整合酶、逆转录酶、蛋白酶等)和病毒包膜蛋白(可决定病毒感染宿主的靶向性)。 病毒基因组中还有2个调节基因tat、rev，其表达的蛋白可调节3个结构基因的表达水平以及控制整个病毒复制过程。此外还有vif、vpr、vpu和nef4个辅助基因，它们编码的蛋白参与了病毒的成熟、释放与对宿主细胞的感染过程，是慢病毒的毒力成份。而在基因组两侧尚有两个长末端重复序列(LTＲ)，其包含了复制所必需的顺式作用元件。 慢病毒载体的发展 慢病毒自被开发以来就吸引的大量学者们的关注并不断被改造，主要目的是提高安全性和可控性。最早的慢病毒载体是由包装成分和载体成分构成二质粒表达系统，由于可制得病毒滴度较低，且在转染时可因简单重组而产生有复制能力的病毒(RCV)，现在已经多不采用。 第2代载体系统最早由Naldini等构建，为含有包装质粒、包装蛋白和载体质粒的三质粒表达系统，后经不断改进删除了大部分的致病基因而基本上仅保留gag、pol、env3个结构基因，极大的降低序列重叠的概率，也就大大减少了产生RCV的可能，安全性提高的同时也能通过离心浓缩获得高滴度的病毒，而其包装质粒也不产生病毒包膜蛋白，而由水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G或双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)膜蛋白构成病毒包膜，不仅扩大了可感染的细胞种类范围，同时也能提高病毒的稳定性。 近年来，学者们为避免目的蛋白长时间持续的表达，构建可调控性慢病毒载体正逐渐成为研究热点，被称为第三代载体系统，此类载体现多为含有四环素或其衍生物如多西环素调节性转基因，在它们的作用下可控制目的蛋白的表达水平。 生物安全性 由于HIV－1型慢病毒载体的天然宿主为人类，所以其生物安全性特别受到关注，其中的关键在于避免ＲCV的产生。慢病毒载体系统发展到现在，已经在基因结构上做了大量的优化，不仅删掉了自身大部分致病基因并且将构建载体必需的病毒基因分散到多个质粒中，形成ＲCV需要在多个不同的质粒上发生多次非同源重组，这样在保证高转染效率的同时可有效的避免ＲCV的产生。还有的学者更从根本上改造病毒载体系统结构，如SachdevaG等将HIV－1型和HIV－2型慢病毒进行杂交或嵌合，得到一种安全性更高的慢病毒载体。此外，调节性基因的加入使得目的蛋白的表达量得到有效的控制，可以避免过度治疗。 为了能更好的观察慢病毒表达目的蛋白的情况，常常在慢病毒基因中增加报告基因，最常用的就是绿色荧光蛋白(GFP)。蒋涛等的研究显示，慢病毒载体介导eGFP标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)后，eGFP可稳定高效表达，并且对细胞的生物学特性无明显影响。 慢病毒载体在骨修复领域的应用 通过基因工程技术治疗骨缺损、骨坏死相比传统手段具有无可比拟的优势。慢病毒载体介导的基因治疗技术不仅可以高效、持续、可控地于局部释放高生物活性的成骨类生长因子并且可以从根本上解决外源性生物蛋白成骨作用弱、价格高、降解速度快等缺点，因而获得了学者们的空前关注。骨形态发生蛋白2(BMP－2)是骨缺损修复领域里研究最多最深入、效果最确切的成骨生长因子。 孙健等的实验证实携带BMP－2基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)后，BMP－2