抗人红细胞血型糖蛋白A非多态性表位单克隆抗体的制备和鉴定.docVIP

血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA）是红细胞膜上含量最丰富的唾液酸糖蛋白，由131个氨基酸组成，每个红细胞上约有1×106个GPA分子［1,2］。GPA和其它3种血型糖蛋白（GPB、GPC、GPD）在维持红细胞间距离，调节红细胞和血管内皮细胞及其它血细胞相互作用方面发挥着重要作用［3］。GPA的氨基酸序列在第1和5位上存在多态性，反映在血清学上即为MN血型，M抗原为Ser1、Gly5，N抗原为Leu1、Glu5。1982年，Anstee和Edwards报道了3种能检测GPA上不同表位的单克隆抗体（单抗），它们中没有1个是抗M或抗 N；此后，国外又有多例针对GPA非多态性表位的单抗被报道［1］。这些抗体在研究GPA和稀有MNS变异型方面发挥了重要作用。我们制备并鉴定了２例抗 GPA非多态性表位的单抗，现报道如下。???? 1 材料与方法???? 1.1 动物免疫 以人脐血红细胞为抗原免疫6只6—8周龄的BALB/c雌性小鼠［证号：SYXK（苏）2005 0001，苏州贝尔达生物医药科技有限公司］，前3次腹腔免疫，注射40％的红细胞悬液1ml/次，最后1次尾静脉注射10％RBC样品0.5ml；3d后取脾细胞融合。???? 1.2 杂交瘤细胞系的建立 从小鼠眼眶取血，血清和成人O细胞反应，取凝集最强的2只小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0（扬州大学比较医学中心李厚达教授赠予）作聚乙二醇（polyethyene glycol,PEG）（批号P7181，SICMA公司）融合；融合细胞在次黄嘌呤氨甲蝶呤胸腺嘧啶核苷（polyethylene glycol amsnopterin thymidime,PAT）选择性培养基（批号H0262，SICMA公司）中作选择性培养；阳性克隆采用有限稀释法作≥3次亚克隆，直至得到单克隆细胞株。???? 1.3 杂交瘤细胞株的筛选 采用微板凝集法筛选杂交瘤上清：加杂交瘤细胞培养基上清20μl/孔，再加1％多人份混和、GPA阳性的成人O细胞PBS悬液20μl，800r/min 3min，振荡看凝集结果；然后于37℃水浴箱孵育30min，加10μg/ml羊抗鼠IgG（批号9546，美国Rockland公司）40μl/孔，800r/min 3min，振荡看抗鼠球蛋白凝集试验结果。???? 1.4 抗体特异性鉴定 用试管法将微板法筛选出的阳性克隆培养基上清与稀有MK细胞（GPA和GPB都缺失）、SsU细胞（GPB缺失）、MM和NN型红细胞（均为本室稀有血型细胞库冻存细胞）作凝集试验，鉴定抗体特异性。???? 1.5 单抗亚型鉴定 采用Mouse Mab Isotyping Test Kit（批号5214K16，荷兰Hbt公司）鉴定单抗亚型，按试剂盒说明书操作。???? 1.6 单抗结合抗原表位的特性鉴定 所得单抗分别和木瓜酶、无花果酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、唾液酸酶（批号依次为072K10411、115H05591、064K7698、034K1507、072K10411，均购自SIGMA公司）处理红细胞反应［4］，以未处理红细胞作对照，比较凝集强度的变化。???? 2 结果???? 2.1 杂交瘤细胞系的建立及单抗特异性鉴定 微板凝集法共筛选出15株阳性细胞，经抗体特异性鉴定筛选出2株分泌抗 GPA非多态性表位单抗的杂交瘤细胞株，分别为Q6D7和Q7C9（表1）。???? 表1单抗特异性鉴定结果 ???? 2.2 单抗亚型鉴定 所得2株单抗均属IgG1亚类，Kappa型轻链。? 2.3 单抗结合抗原表位的特性鉴定 2株单抗和酶处理细胞（3人份混和、GPA阳性O细胞）的反应格局类似（表2）。木瓜酶、无花果酶、唾液酸酶处理后凝集强度均有减弱，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理后凝集强度不变，说明2株单抗在GPA上的结合表位抗胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶作用，但对木瓜酶、无花果酶、唾液酸酶敏感。???? 表2单抗和酶处理O细胞的反应格局???? ???3 讨论 ?? 国外的大部分抗 GPA单抗经过严格的抗体性质鉴定，对抗体在GPA上的结合位点有比较清楚的结论［5—8］。相对而言，国内的绝大部分抗 GPA为特异性抗 M或抗 N，而非针对GPA上的非多态性抗原表位［9，10］。我们利用2种稀有红细胞MK细胞和S s U 细胞，结合MN纯合子细胞，对抗体进行特异性鉴定，证明所得单抗针对的抗原决定簇为GPA上M、N以外的非多态性表位。 ?? 国际上把各种检测GPA上非多态性抗原决定簇的抗体统称为抗 Ena［1］。Issitt等［11］根据蛋白酶对相应抗原决定簇的影响，将抗 Ena划分为3大类：1）抗 EnaTS是识别对胰蛋白酶敏感的抗原决定簇，不和胰蛋白酶、无花果酶或木瓜