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色谱技术Chromatography 本章主要知识点 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 一、定义 也叫色谱或色层、层析 利用混合物中各组分物理化学性质的差别，使其以不同程度分布在两相中，从而随流动相移动的速度不同而进行分离的方法。 1903 ，碳酸钙柱，植物色素的石油醚萃取物，石油醚冲洗，数条相互分离的条带 三、色谱分离的基本概念 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 阻滞因子Rt 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度：L---柱长 四、吸附色谱 原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离 关键要素：吸附剂和展开剂的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 常用展开剂的洗脱能力及极性比较 介电常数越大，极性越强。常用溶剂的极性次序： 冰醋酸＞水＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞醋酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞甲苯＞四氯化碳＞环己烷＞己烷 一般吸附色谱的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 五、分配色谱 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 要素：固定相、载体、流动相 固定相吸着在多孔物质（载体）上，载体空隙内流过的液体为流动相 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相，常用水、缓冲溶液或为水所饱和的有机溶剂 流动相一般用为水所饱和的有机溶剂或水－有机溶剂的（互溶）混合液 如所处理的物质憎水性很强，如高级脂肪酸等，则可将载体经适当处理，吸着有机溶剂作为固定相 ，而以水为流动相，进行色谱分离 ，称为反相色谱法 *反相色谱固定相是非极性的, 流动相是极性的 六、离子交换色谱 以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 常用的离子交换树脂 葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列 七、分子筛凝胶色谱 在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 分辨率低 分子筛凝胶色谱原理 凝胶的参数 排