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色层分离法 概述 历史 色层分离的基本原理 色层系统组成 色层分离的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 层析分离分类 按溶质分子与固定相相互作用机理 层析分离分类 按操作形式不同分类： 层析分离分类 根据流动相分类 色层分离的基本概念 色层分离的基本概念 洗脱体积 色层分离的基本概念 塔板理论 吸附层析技术 原理 吸附层析技术 氧化铝 分配层析技术 利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 分配层析技术 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶 分配层析技术 固定相 凝胶层析法 基本原理 凝胶层析法 凝胶层析法 凝胶层析法 优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐 凝胶理化性质 凝胶理化性质 粒度： 操作 凝胶层析法 凝胶层析法 凝胶的种类和性质 凝胶层析法 琼脂糖凝胶 凝胶层析法 琼脂糖凝胶 离子交换层析 原理 离子交换层析 离子交换层析 常用的离子交换剂 葡聚糖凝胶型 Sephadex 纤维素系列离子交换剂 Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, 疏水作用层析 在载体表面连接疏水基团，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。 疏水作用层析 吸附剂： 配体：苯基C6，辛基C8，烷基C18 介质：硅胶、树脂如phenyl、 sepharose FF 、 sepharose CL-4B 亲和层析 利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术 亲和层析 具有特异性亲和作用的生物分子 亲和层析 亲和层析配基的选择 蛋白质分离常用的色谱方法 免疫亲和层析 属于吸附色谱中的一种，利用抗原-抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离 免疫亲和层析介质的获得： （1）获得抗体 （2）抗体连接到载体上 缺点： 处理量小 稀释 排阻极限 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量 分级范围 指当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围 床体积 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积 空隙体积 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间 粗(相当于50目) 中(100目) 细(200目) 极细(300目) 溶胀 装柱 加样 洗脱 LogM A B C LogM测 V测 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关 LogM=k1-k2Ve 交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 葡萄糖分子间主要是α-1,6-糖苷键 交联剂：1-氯-2，3-环氧丙烷 981(10) 5 72 1000-200000 5000-800000 30-40 20±2.0 40-120 10-40 中粗 超细 Sephadex G-200 1472(15) 5 72 1000-150000 5000-400000 20-30 15±1.5 40-120 10-40 中粗 超细 Sephadex G-150 3434(35) 5 48 1000-100000 4000-150000 15-20 10±l.0 40-120 10-40 中粗 超细 Sephdex G-100 4905(50) 3 24 1000-50000 3000-70000 12-15 7.5±0.5 40-120 10-40 中粗 超细 Sephadex G-75 9810(100) 2 6 500-10000 1500-30000 9-11 5.0±0.3 100-300 50-150 20-80 10-40 粗 中粗 细 超细 Sephadex G-50 9810(100) 2 6 100-5000 1000-5000 4-6 2.5±0.2 100-300 50-150 20-80 10-40 粗 中粗 细 超细 Sephadex G-25 9810(100) 1 3 1500 1500 2.5-3.5 1.5±0.2 40-120 Sephadex G-15 9810(100) 1 3 700 700 2-3 1.0±0.1 40-120 Sephadex G-1O lOO ℃ 20℃ 线性葡聚糖 分子质量/Da 球蛋白分 子质量／Da 最大流体 静力压/Pa (cmH2O) 溶胀所需 时间/h 最适分段分离范围