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11．人血浆中氯唑沙宗浓度的测定方法 仪器与色谱条件 11.1.1仪 器 TSQ Quantum Access 三重四极杆串联质谱仪 配备电喷雾离子源（ESI）源及 Xcalibur 2.0.7 数据处理系统（美国 Thermo Scientific公司）；岛津LC-20AD液相泵, 岛津CBM-20A系统控制器, 岛津CTO-20A柱温箱，SIL-20AC 自动进样器(日本岛津公司)；电子天平(型号BS124S，赛多利斯Sartorious公司)； 旋涡混合器（型号XW-80C，上海医大仪器厂）；高速离心机（型号1612-1，上海手术器械厂）；数控超声清洗器（型号KQ2200DE，昆山市超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（型号HH-2，国华电器有限公司）11.1.2质谱条件 用LC-MS/MS进行测定，离子源为ESI 源，离子化方式检测，喷雾电压为 kV ；加热毛细管温度为 350 ℃；鞘气（N2）压力为40Arb；辅助气（N2）压力为1Arb；碰撞气（Ar）压力为1.5mTorr；碰撞诱导解离（CID）电压分别为eV（氯唑沙宗），eV（）。扫描方式为选择性反应监测（SRM）用于定量分析的离子反应分别为m/z→m/z 132.1（氯唑沙宗）和m/z→m/z379.3（内标）。 11.1.3色谱条件 色谱柱：SHIMADZU Shim-pack:?VP-ODS；μ, Column?size:?150×2.0 mm； Serial?NO.9042015；柱温：40℃；流动相A为，流动相 B为水相（含5mmol/L醋酸铵）；梯度洗脱，梯度设定为：0～ min，B0%； ～1. min，B10%；1.～4.min，B10%；4.～min，B0%；5～6.min，B0%；流速：0.3mL·min- 1；进样量：5μL。 11.2药品与试剂 11.2.1对照品 对照品Dr. Reddy’s Laboratories Itd公司产品，批号：REWS0801；由中国药品生物制品检定所提供，批号：100364-200301 11.2.2试验试剂 甲醇、乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；醋酸铵为分析纯(南京化学试剂一厂)。11.3方法学确证 11.3.1 样品处理与测定 取人血浆样品200μL至Effendorf管，加入内标(10μg/ml)50μL，混匀后加入乙腈00μL，涡旋振荡1min，12000转/min离心10min取上清液μL，加入990μL甲醇进行稀释，涡旋振荡取上清液μL进样，测定受试者血浆中氯唑沙宗的浓度。 11.3.2专属性试验 在本试验条件下，氯唑沙宗的保留时间约为min，的保留时间约为min。通过对来自6个不同个体的空白血浆测定表明，血浆中的内源性杂质不干扰样品测定，受试者的空白血浆、空白血浆添加氯唑沙宗和内标（）标准品及受试者服用制剂后的血浆样品的色谱图见图1-1至图1-3。图1-1 空白血浆样品测试的LC-MS/MS图氯唑沙宗的色谱质谱图检测内标图1-2 空白血浆加氯唑沙宗（μg/ml）和LC-MS/MS测定试验图谱图谱来源于标准曲线的样品测试） tR氯唑沙宗=3.61min；tR内标=4.01min, C氯唑沙宗=1.02μg/ml） 图1-3 受试者（No.，第一周期，服，采血时间点：.5h）血浆样品测定图谱 tR氯唑沙宗=3.61min；tR内标=4.01min, C氯唑沙宗=5.40μg/ml） 11.3.3标准曲线的建立 取Effendorf管 个，分别加入不同浓度的氯唑沙宗标准品溶液各50μL，置40℃恒温水浴挥干。分别加入健康人空白血浆200μL，使氯唑沙宗浓度分别为0，0.，0.5，1，2，5，10，20μg/ml。按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，以样品和内标峰面积比As/Ais为纵坐标浓度Con.( μg/ml) 为横坐标，以1/c2为权重系数进行回归，得血浆中氯唑沙宗标准曲线（见图2），结果氯唑沙宗在0.-20μg/ml范围内线性良好。回归方程为： =0.0271923+0.346425 *X，R2 = 0.9951，其中Y为样品和内标峰面积比As/Ais），X为氯唑沙宗浓度。预期可满足氯唑沙宗在人体内生物等效性研究。 图2人血浆中氯唑沙宗测定的标准曲线 11.3.4定量下限试验 在Effendorf管中分别加入氯唑沙宗标准品溶液各50μL，置40℃恒温水浴挥干。分别加入健康人空白血浆200μL，使氯唑沙宗的浓度为0.μg/ml。按“11.3.1样品处理与测定”项下操作，将满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax 的1/10