蔗糖酶的分离纯化及鉴定验实目标及PBL问题.docVIP

实验一、蔗糖酶的提取及粗分离 一、?实验目标 1.?选择含蔗糖酶丰富的、价廉物美的材料，采用提取得率比较高的方法进行蔗糖酶的提取，得到初提取液。 2.?对初提取液进行初步分离，为后续的纯化提供样品。 二、?导学问题 1．蔗糖酶的用途，研究蔗糖酶的意义？蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)叉称转化酶(Invertase)。可作用于B-1，2糖苷键，将蔗糖水解为n葡萄糖和n果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值‘“。可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。?10分 2．蔗糖酶有哪些性质？包括酶的适用pH和温度、等电点等。蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5。CuCl：对蔗糖酶有激活作用，而AgC]对蔗糖酶则其抑制作用，NaCI，KCl，FeSO。对蔗糖酶活性无明显作用，但相对活力都保持在70％以上。等电点5.6 ?10分 3．蔗糖酶存在于什么材料中？你选择哪种材料来提取？为什么？?10分 4．蔗糖酶属于胞内酶，提取前需要破壁，破壁方法有哪些？?15分 5．蔗糖酶提取溶剂如何选择？为什么？?10分 7．蛋白质的粗分离方法有哪些？各有什么优缺点？如何选择？?25分 实验二、蔗糖酶的层析分离（一） 一、?实验目标 ?根据初步纯化以后的样品性质选择一种柱层析方法进行纯化，目标是纯化效果好，回收率高。 二、?导学问题 1．蛋白质层析分离方法有哪些？?10分 2．各层析分离方法的原理？适用范围？?15分 3．准备用哪种层析方法进行纯化？?5分 4．针对本实验的层析方法，选择实验条件有哪些？如何选择？?10分 5．如何评价纯化方法的优劣？?10分 6．如何快速测定纯化过程中样品的酶活力？5分 7．什么是穿透峰？穿透峰中包含哪些物质？?10分 8．穿透峰如果有酶活需要保存作为下个实验的样品吗？为什么？?10分 9．什么是柱子的平衡？平衡的目的是什么？?5分 10.?梯度洗脱方法有哪几种？各有什么优点？?10分 11.?洗脱液的?pH如何选择？?5分 12.?实验过程中要注意的事项？?5分 实验三、蔗糖酶的层析分离（二） 一、实验目标 根据上个实验纯化以后的样品性质选择另一种层析方法进行纯化，目标是纯化效果好，回收率高。 二、导学问题 1.?第二步纯化采用什么层析方法？为什么？?20分 2.?该层析方法的原理？?20分 3.?如何选择实验条件？为什么？?20分 4.?影响样品在柱内移动快慢的因素有哪些？?25分 5.?实验过程中要注意的事项？?15分 实验四、蔗糖酶活力测定 一、?实验目标 ?对提取、纯化得到的各个样品进行酶活力检测，考察各纯化方法的酶的回收率，了解是什么导致了酶的损失？ 二、?导学问题 1．什么是酶活力？酶活力单位？蔗糖酶活力单位的定义？10分 2．酶活力测定方法有哪些？如何选择？?20分 3．酶活力测定方法的干扰因素有哪些？如何避免？?15分 4．酶反应需要控制哪些实验条件？?5分 5．如何控制温度、pH、反应时间？?10分 6．终止酶反应的方法有哪些？如何选择？?10分 7．什么是对照？为什么要做对照？?10分 8．?比色法测定时，OD值超过标准曲线的线性范围时，为什么不能直接稀释已经显色的样品，而必须改变取样量重新显色，再测OD值？?10分 9．实验过程中应注意的事项？?10分 实验五、蛋白质含量测定方法 一、实验目标 对提取、纯化得到的各个样品进行蛋白质含量检测，考察各样品的比活力大小，各个纯化步骤的纯化效果。 二、导学问题 1．蛋白质含量测定方法有哪些？各有什么优缺点？?20分 2．各测定方法的原理？?20分 3．对本实验选择哪种方法比较合适？为什么？?15分 4．选择的测定方法有哪些干扰因素？如何避免？?15分 5．如何设置对照组？?10分 6．什么是比活力？比活力反映的是酶的什么特性？?10分 7．实验过程中应注意的事项？?10分 实验六、蛋白质的电泳分离 一、?实验目标 ?对提取、纯化得到的各个样品进行凝胶电泳分析，考察各纯化方法得到的酶的纯度，测定蔗糖酶的相对分子量。 二、?导学问题 1．蛋白质电泳分离的原理？?10分 2．蛋白质电泳的用途？?5分 3．蛋白质电泳分离方法有哪些？各有什么特点？?10分 4．聚丙烯酰胺凝胶电泳有哪几种方法？具有什么效应？各有什么优缺点？?15分 5．聚丙烯酰胺聚合原理？凝胶孔径如何调节？?5分 6．SDS与普通PAGE的原理？区别？?10分 7．影响蛋白质电泳分离效果的因素有哪些？10分 8．过硫酸铵、TEMED、SDS的作用？?10分 9．为什么分离胶灌胶后要在上面覆盖一层水？?5分 10．蛋白质染色方法有哪些