毛囊组织DNA提取方法的研究.doc

人头发毛囊组织DNA提取方法的研究 技术保障与研发部 魏宏泉 摘要 本研究以人头发的毛囊组织为材料，在动物组织总DNA提取的经典技术方案基础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织DNA提取方法进行了优化，并设计了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在40分钟时间内获得约0.5(g组织DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时，一次提取过程所耗药品试剂的成本约为0.3元，大大低于以微量血为材料的试剂盒提取法的成本。 在以RFLP法对线粒体12s rRNA基因1555位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织DNA的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA提取方法的技术体系。 材料与方法 人头发毛囊组织 取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于1.5ml Eppendorf管内。 试剂配制 Proteinase K Proteinase K用去离子水溶解，浓度20mg/ml。 组织消化液 10mM Tris-HCl，pH7.5 10mM EDTA 10mM NaCl 0.5％ SDS LiCl溶液 无水LiCl用去离子水溶解，浓度为7.5M。 TE溶液 10mM Tris-HCl，pH7.5 0.1mM EDTA，pH8.0 参考操作程序 加入60(l消化液，再加入1(l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。 于55℃水浴2小时。 加入60(l LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。 13 000rpm离心15分钟，将上清移入一个新的离心管中。 加入240(l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。 加入20(l TE缓冲液溶解DNA。 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 头发数量对DNA提取结果的影响 将拔取的头发分为6组，分别为1、2、3、4、5、6根头发，按1.3中的参考操作程序进行操作，提取DNA并用电泳检测结果。 蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响 将拔取的头发分为4组，每组1根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。 将拔取的头发分为6组，每组2根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。 将拔取的头发分为6组，每组2根，其中5组在操作程序中加入的蛋白酶K浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶K，其余步骤按参考操作程序进行。 将拔取的头发分为5组，每组1根，在操作程序中不进行加入蛋白酶K及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。 优化操作程序的多样本比较实验 以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10组，以下列操作程序提取DNA： 加入60(l消化液，再加入1(l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。 于55℃水浴10分钟。 加入60(l LiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。 13 000rpm离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。 加入240(l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。 13 000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。 13 000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。 加入20(l TE缓冲液溶解DNA。 用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。 各取2(l DNA溶液作为模板进行PCR，PCR反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的RFLP标准操作程序”进行。 结果与分析 2.1 头发数量对DNA提取结果的影响 以1-6根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组DNA，1-3根头发组的DNA产量有较为明显的随头发数增多而产量也增多的变化，3-6根头发组的DNA产量则没有明显