水体污染物对淡水贝类抗氧化系统的影响.doc

水体污染物对淡水贝类抗氧化系统的影响 一、实验目的： 重金属以及化学农药(除草剂)残留和多化芳烃等有机污染是造成我国淡水水体污染的主要污染物。贝类属于敏感型底栖生物，对水质的要求比较高。可作为水环境污染物危害的指示物。同时，生物体内抗氧化酶活力的高低可反映机体的抗病力。本实验拟采用酶分析法探讨水体污染物对淡水贝类抗氧化系统及主要抗氧化酶的影响。对培养学生从事水生生物免疫学研究具有重要的指导意义。 二、实验原理： 水体污染可对贝类造成氧化胁迫，产生大量的活性氧族（ROIS），ROIS能诱发贝类的抗氧化防御系统对其作出应激反应。抗氧化系统的变化情况反映了机体免疫力的高低。通过测定实验蚌抗氧化系统的主要指标（SOD活性、CAT活性、GPX活性、GSH含量、ROS含量）和半定量检测主要抗氧化酶（SOD、CAT、GPX）的表达变化，研究各种胁迫条件下淡水蚌的敏感指标，用于诊断环境污染以及评价污染物对淡水蚌的毒性效应。 三、仪器、设备、及试剂： 冷冻离心机1台，碾砵 10个，起蚌器 5只，分析天平2台（0.01g），液氮罐 1个，分光光度计1台、匀浆器、剪刀、镊子、1mL注射器、10ml的离心管、水族箱或塑料框（50L）8个、充氧泵 4个、联苯胺 25g、考马斯亮蓝G-250（分析纯）25g、牛血清白蛋白（分析纯）25g、硫代巴比妥酸 （分析纯）10g、30% 的H2O2 （分析纯）、500ml 1瓶、正磷酸 500ml，1瓶、谷胱甘肽 (GSH)测定试剂盒 100次/盒 ，南京建成生物公司；3个；谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒100次/盒，南京建成生物公司；3个； 10ml注射器、100支，10ml离心管、100支 10ml试管、100支，100ml烧杯、 2个，500ml，2只；1000ml，2只，容量瓶500ml,100ml 各2个；广口瓶1000，2000ml各2个，匀浆器 10ml 30支；移液枪 1mL, 100μL, 5mL支 各一支。 水浴锅，一台 四、实验内容 内容一、重金属和有机污染物对褶纹冠蚌的胁迫 （8课时） 1、仪器\试剂和设备 PH计、量筒、烧杯、滤纸，硫酸锌或硫酸铜、苯酚或联苯胺、水族箱、充氧泵 2、方法 选择壳长为(9.66±1.07)cm、壳高(6.58±0.85)cm的健康蚌，在水族箱中暂养一周以上，水温控制在20℃、PH 6.8-7.0，保持水中通气(连续冲气暂养)，每天换水一次。 将120只褶纹冠蚌随机分成6组，每组24只，其中一组作为对照，不加入其他任何物质，其他5组用于实验，实验组中3组分别加入重金属（铅或锌）使终浓度为2mg/L（高浓度组）、1mg/L（中浓度组）、0.5mg/L（低浓度组），两组加入有机污染物（联苯胺或苯酚）使终浓度为（高浓度组）、低浓度组。 各种缓冲液的配制。 内容二、酶原液的提取（8课时） 1、仪器\试剂和设备 注射器，离心管、阿氏液、天平、离心机等 2、血清样品的制备 重金属和有机物胁迫后，在0、12、24、48、72、96h分别用2.5mL注射器5号针头从对照组和实验组蚌闭壳肌血窦中取血约1.5mL, 每个时间段每组取4只，以3600 r／min的转速低温(4℃)离心10min，移出上清液，获得实验所用血清样品，置于4℃冰箱中备用。 3、肝胰脏提取液的制备 蚌取血后，取出适量肝胰脏，滤纸吸干水分后称重，加入无菌生理盐水(0.9%)于冰浴中匀浆，使浓度达到0．1 g／m L，在4℃条件下，以3000 r／min离心l0 min，除去沉淀后获得蚌的肝胰脏组织提取液，并以其作为酶原液进行酶活性测定，置于4℃冰箱中备用。 内容三、蛋白浓度的测定 考马斯亮蓝G-250比色法（8课时） 1. 目的??? 学习和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法。2、 原理??? 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，其结构如下图。它在游离状态下最大吸收波长为464nm。 ??? 由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。 ??? 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质含量的测定。该方法非常灵敏，蛋白质最低检测量为5mg，而且此法操作简便、快速，干扰物质少，是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯上而造成误差，每次更换检测样液时，应及时用乙醇洗涤比色皿，再用蒸馏水冲洗残留的乙醇。 3、实验材料及设备??? （1）材料???