2染色体与DNA专用课件.pptVIP

原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。 第六节 核酸的分离纯化与测定 原则： （1）破碎细胞； （2）除去蛋白质、脂类、糖类等成分； （3）避免激烈搅拌和振荡； （4）除去RNA（或DNA）； （5）抑制相关酶； （6）低温操作。 一、DNA的分离纯化 （1）在破碎细胞的同时，用浓盐酸或十二烷基硫酸钠（SDS） 使DNA与相关的蛋白质解联。 （2）蛋白酶K消化以使蛋白质部分分解。 （3）通过缓冲液、饱和的苯酚抽提以除去蛋白质。 （4）通过Rnase消化使RNA降解。 （5）利用氯仿-异戊醇处理，进一步除去蛋白质。 （6）加入二倍体积的无水乙醇沉淀DNA。 （7）琼脂糖凝胶电泳进一步分离和鉴定。 二、核酸的测定： （一）、核酸含量的测定 1、紫外吸收法 2、定磷法（钼蓝反应） 3、定糖法（地衣酚反应、二苯胺反应） （二）、核酸纯度的鉴定 1、紫外吸收法（如果比较纯的核酸样品，OD260/OD280的值是固定的，二者的比值大约是1.8—2.2,如果大于2.2说明有RNA污染，如果小于1.8说明有蛋白质污染）。 2、凝胶电泳法 2.0 nm 小沟 大沟 （1）DNA的双螺旋模型特点 ? 两条反向平行的多聚核苷酸链沿一个假设的中心轴盘绕形成右手螺旋。 ?磷酸和脱氧核糖作为不变的骨架位于双螺旋的外侧，作为可变成分的碱基位于内侧，链间碱基按A T，G C配对（碱基配对原则，Chargaff定律） ?螺旋直径2nm，相邻碱基平面垂直距离0.34nm,螺旋每转一圈包含10个碱基对，螺距为3.4nm ? DNA的双螺旋结构稳定因素： 主要是横向碱基互补之间的氢键和纵向平面间的碱基堆积力。 （2）DNA双螺旋结构的多样性 B型结构（常见的右手螺旋） A型结构（少见） Z型结构（左手螺旋，少见） 除双螺旋结构外,还有极少数的DNA分子是三螺旋结构的. 2、DNA双螺旋结构的意义 该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对规律，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。 三、DNA的高级结构 在二级结构的基础上DNA 双螺旋进一步卷曲而成。其表现形式有：开链线状（线性DNA）、闭链环状（闭环DNA ）、超螺旋结构、核小体结构等。 1、原核生物 在双螺旋基础上进一步扭转盘曲,形成超螺旋，体积进一步压缩。 DNA超螺旋结构的形成 原核生物的染色体DNA在细胞内紧密缠绕形成致密的小体，称为拟核，约占细胞体积的1/3。 2、真核生物（核小体） 在真核生物中，DNA双螺旋盘旋、缠绕组蛋白八聚体，形 成左手超螺旋，称核小体。 核小体由146bpDNA围绕8个组蛋白分子（H2A、H2B、H3、 H4各两个），H1结合在连接区，所以每个核小体大致包含 200bpDNA。 DNA （2nm） 核小体链（ 11nm，每个核小体200bp） 纤丝（ 30nm，每圈6个核小体） 突环（ 150nm，每个突环大约75000bp） 玫瑰花结（ 300nm ，6个突环） 螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花） 染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花200bp） 真核生物染色体DNA的进一步旋转折叠 3、DNA的功能： 简单讲：DNA是遗传信息的载体 详细讲：DNA不仅是生物遗传信息复制的模板，也是基因转 录的模板，不仅是生命遗传繁殖的物质基础，也 是个体生命活动的基础。 第四节 核酸的性质 一、一般的理化性质 DNA为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。 线性大分子（粘度高。抗剪切力差） 室温条件下，DNA在碱性溶液中易变性，但不水解，但 RNA水解 微 溶于水，不溶于有机溶剂，但能溶于小于5%的乙醇水溶液，当乙醇浓度达到50%时，DNA析出沉淀，当乙醇浓度达到75%时，RNA析出沉淀。 二、核酸的两性性质及等电点 1、核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷）。 2、RNA 的等电点PH为2-2.5；DNA 的等电点PH为4-4.5. 三、核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在