第四章分子生物学方法摘要.pptVIP

* * 2-DE包括等电聚焦（isoelectric focusing, IEF）及SDS两种电泳技术。该方法根据蛋白质的两个性质即等电点和分子量。 以两性电解质为介质的电泳体系，不同等电点蛋白会聚集在介质的不同区域（等电点）； SDS将不同分子量的蛋白质分离。 * * 凝胶的图像处理和分析 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： * * 二、蛋白质免疫印迹实验 原理： 确保蛋白质解离为单个多肽亚基能与SDS结合； 通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离； 将蛋白质固定于膜上； 以抗体识别待检蛋白（抗原）。 固 定 物 2Ab E 蛋白质 （抗原） 1Ab * * 典型的印迹实验包括五个步骤： ① 蛋白样品的制备； ② 经过SDS分离样品； ③ 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域； ④ 用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与固定的非标记抗体结合； ⑤ 洗去未结合的一抗，加入标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分。 * * * * 用于检测的二级抗体一般分为三种： 放射性标记的抗体 与酶相偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶 *