双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法.pptxVIP

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2017-02-14 发布于湖北
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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法.pptx

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双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法

双脱氧末端终止法测序的原理主讲：氧气yunFrederick?Sanger双脱氧末端终止法DNA聚合酶不能从头合成子链如果dNTP的3’碳上没有羟基ddNTP——双脱氧核苷酸基本原理：DNA复制ddNTP的结构聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA复制的特点酶：DNA聚合酶底物：dNTP模板：单链DNA引物：需要引物的作用：提供3’羟基末端ddNTP的特点ddNTP 3’位不是-OH，但5’磷酸基团正常。DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP。ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端后，DNA链的延长会被迫停止。聚丙烯酰胺凝胶电泳特点精度相当高！能分离长度达300-500个碱基，而差别仅一个碱基的同系单链核苷酸序列。操作步骤1．制备单链模板与引物退火2．链延伸---终止反应3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳4.放射自显影5.阅读测序结果制备单链模板与引物退火双链DNA单链DNA单链DNA加入引物，加热，退火带引物的模板单链DNA链延伸---终止反应 EDTA 乙二胺四乙酸，一种二价金属离子螯合剂，DNA聚合酶对Mg2+浓度十分敏感。核素标记的dNTP分成四管双脱氧鸟苷双脱氧腺苷双脱氧胸苷双脱氧胞苷37℃下反应5min后加入EDTA使DNA聚合酶失活带引物的模板单链DNA含有各种长度DNA分子的溶液聚丙烯酰胺凝胶电泳95℃加热变性冰上冷却点样开始电泳电泳完成，得到凝胶含有各种长度DNA分子的溶液放射自显影与照相机原理相似，利用射线使胶片感光，然后通过显影过程把 “像”显示出来。固定凝胶真空抽干放入X射线片夹电泳完成，得到凝胶得到X射线片阅读测序结果一般是从下往上阅读X射线片上的显影区带，即从测序引物的5’端读向3端。Thank you!