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不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响 ⅹⅹⅹ（姓名） 摘要：本实验以处于对数生长期的小鼠胎儿成纤维细胞为材料，采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术，比较二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GL）这三种冷冻保护剂分别与血清的不同配置组合以及这三种保护剂之间的不同配置组合对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率的影响。结果发现：以10％DMSO＋20％EG的冷冻保护剂冷冻效果最好，解冻后细胞的成活率显著高于其他组合类型的冷冻保护剂。 关键词：不同冷冻保护剂 小鼠胎儿成纤维细胞 成活率 胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎，采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻，使其在-196℃的液氮中停止代谢或者减弱到足够小的程度，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能长期保存胚胎的一种生物技术。自1972年Whittingham首次报道植入冷冻小鼠胚胎获得正常后代以来，冷冻技术已经在多种细胞领域中取得成功。近几十年来，丙二醇、二甲基亚砜和甘油结合蔗糖已经广泛应用在哺乳动物及人类胚胎的冷冻保存中[1]。 成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。 本实验通过对小鼠胎儿成纤维细胞的培养，建立小鼠胎儿成纤维细胞系，并用DMSO、EG和GL作为冷冻保护液，添加10%-30%的FCS的DMEM为基础冻存液保存成纤维细胞，筛选合适小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的保护液组分，为动物细胞核移植、转基因等提供核供体材料。 1 　材料和方法 材料与仪器 实验材料：小鼠胎儿成纤维细胞 实验试剂：DMEM培养液、20％胎牛血清（FBS）、分析纯二甲基砜（DMSO）或甘油、消化液（DMEM+0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA）、培养液(DMEM+10％胎牛血清),0.1%台盼蓝溶液,10%EG和10%GL冷冻剂 实验器材：超净工作台、CO2培养箱、离心机、高压灭菌锅、电热干燥箱、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、分析天平、吸管、25ml卡氏培养瓶、无菌60mm培养皿、烧杯（100ml）、眼科剪、眼科镊、不锈钢筛（100μm）、离心管（100ml）、细胞冻存管、血细胞计数板。 1.2 实验方法与步骤 1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的获取 处死孕鼠（引颈法），剪开腹腔，取出胎儿，去头、尾、内脏，用酶消化的方法，用DMEM+0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化液2-3ml消化3-5min并收集细胞，2500r/min离心5min弃上清液，用DMEM洗涤液清洗细胞1-2次。 1.2.2 细胞的稀释与分装 组织块培养法和消化法接种，3天后更换培养液；再过三天，进行细胞的传代培养，并于三天后更换培养液；再3天后，冷冻保存操作：取出传代细胞，去除培养液。 1. 2. 3 冻存 将细胞冻存管用棉花包好放入泡末小盒,固定好后放入-70℃冰箱中，冻存一个星期。 1. 2. 4 解冻 将冻存取出,立即投入盛有38℃加入适当培养液稀释并调整细胞浓度到5*105 /ml,以每瓶3ml接种到培养瓶中,置37℃、5%二 用血细胞计数板计数，镜检四个大方格，记录活细胞数与细胞总数，并计算其戚率，评价冷冻效果。 2. 结果与分析 2.1 实验结果 冷冻剂 血清浓度 平均存活率 10％ DMSO 10％FCS 63.02% 20％FCS 67.27% 30％FCS 63.34% 10％ GL 10％FCS 36% 20％FCS 39.6% 30％FCS 42% 10％ EG 10％FCS 38.07% 20％FCS 40.27% 30％FCS 37.82% 5％DMSO＋5％EG 10％FCS 52% 20％FCS 48.54% 30％FCS 47.28% 5％DMSO＋5％GL 10％FCS 49% 20％FCS 33% 30％FCS 51% 细胞存活率=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）*100% 2.2 10％DMSO与不同的配置比例血清的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响 10％DMSO与血清不同配置比例的冷冻剂对细胞冷冻效果的影响 血清浓度 存活率％ 10%FCS 63.02% 20%FCS 67.27% 30%FCS 63.34% 从左表可以看到：存活率并不与血清浓度成正比的关系，其中血清浓度为10%和30%时，两者的成活率差不多，而当血清浓度为20%时，其存活率最高。且在本实验中，10％DMSO＋20％FCS的冷冻保护剂冷冻效果最好。