DNS法淀粉含量测定供参习.docVIP

淀粉含量测定 侯曼玲，食品分析，化学工业出版社，北京，2004 1 实验原理 3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 2.材料与方法 本实验用到的实验仪器有： 具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；烧杯：100mL×4；三角瓶：100mL×1；容量瓶：100mL×3，50mL×3；刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；沸水浴；冰浴；扭力天平；721型可见分光光度计 2.3实验试剂 乙醚，乙醇溶液(φ=85%)，HCl溶液(1+1)，NaOH溶液：配制的质量浓度分别为10%和40%，Pb(Ac)2溶液(200g/L)，Na2SO4溶液(100g/L) 甲基红指示剂(2g/L) 溶解0.2g甲基红于60mL乙醇中，加水稀释至100mL 1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。 2.4实验步骤 2.4.1 制作葡萄糖标准曲线 取7支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL葡萄糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 7 1.4 0.6 1.5 1.4 8 1.6 0.4 1.5 1.6 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，做出标准曲线。 2.4.2 样品处理 准确称取2-5g磨碎、过40目筛的样品，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用30mL乙醚分三次洗去样品中的脂肪，弃去乙醚。再用乙醇溶液约150mL分数次洗涤残渣，以除去可溶性糖类。滤干乙醇后用100mL水将残渣转入250mL锥形瓶中，加入盐酸(1+1)30mL，连接好冷凝管，置沸水浴中回流2h。 回流完毕后，立即置流动水中冷却至室温，加入2滴甲基红指示剂，将水解液调至近中性(先用40%NaOH溶液调至黄色，再用盐酸(1+1)校正至水解液刚变红色为宜；若水解液颜色深，可用精密pH试纸测试，调至pH约为7)。加中性Pb(Ac)2溶液20mL，摇匀。放置10min，使蛋白质等干扰物质沉淀完全。再加等量的Na2SO4溶液，以除去多余的铅盐。摇匀后将全部溶液及残渣转入500mL容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中。用水定容至刻度，混匀、过滤(初滤液弃去)。 2.4.3样品中含糖量的测定 取7支大试管，分别按下表加入各种试剂： 管号 空白 1 2 3 4 5 6 数量 项目 样品量(ml) 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(ml) 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 DNS 试剂(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 加热 均在沸水浴中加热5min 冷却 立即用液动冷水冷却 蒸馏水(ml) 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 光密度(D540) 将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出谷物种子内还原糖与总糖的百分含量。