纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用.docVIP

纳米银胶标记的DNA电化学传感器制备及应用 本文来自工控商务网：/ ? 目的:研究一种新型的纳米银胶标记DNA电化学传感器的制备及应用。方法:通过将纳米银胶标记于人工合成的5端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成银胶DNA电化学探针。利用阳极溶出伏安法检测标记于DNA末端的Ag+，实现对特定序列DNA的测定。结果:经过实验条件的优化，测定DNA浓度在1.0×10-9～6.0×10-7 mol/L范围内呈良好的线性关系，检测限为5.0×10-10 mol/L。结论:该DNA电化学传感器响应快速、灵敏度高、稳定性好，适合于生物分析。 ?? 生物样品中特定DNA序列的测定在生物医学领域具有重要意义[1]，其结果可用于对遗传性和传染性疾病进行鉴别和检测。在众多的杂交检测方法中，放射性同位素标记法存在着放射性污染等弊端，而非放射性标记法如荧光、化学发光和生物素标记方法的检测仪器昂贵，难以实现自动化， 且标记过程繁琐复杂[2]。DNA电化学传感器因具有简便快速、不破坏测试样品、不受溶液颜色影响等优点，已逐渐成为分子生物学研究中直接进行DNA序列检测的方法之一[3，4]。银胶是一种纳米材料，银胶粒子粒径小，比表面积大，表面反应活性高，从而具有良好的催化活性[5，6]。本研究将纳米银胶标记于人工合成的5端-巯基修饰的寡聚核苷酸片段上，制成了高灵敏度、高选择性DNA电化学传感器，实现了对特定序列DNA的检测。 ? ??????? 1 材料和方法 ? 1.1 仪器和试剂 ? CHI650BNanoscope Ⅲa，Digitao Instruments,Inc. Santa Barbara. CA），紫外-可见分光光度计（Varian，美国）。 ? 人工合成的24个碱基的寡聚核苷酸片段(上海生工生物工程公司提供)： ? 探针序列：5-HS-(CH2)6-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3 (SH-ssDNA) ? 互补靶序列：5-TCGACCTGAAATGTTGCGCCGCTC-3 (ssDNA) ? 非互补序列：5-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA-3 (ncDNA) ? 硝酸银、吡咯溶液（分析纯，上海化学试剂公司生产），硼氢化钠（分析纯，Fluka公司生产），0.1 mol/L NaCl和10 mmol/L磷酸盐的混合液（pH=7.0）为缓冲溶液。制备银溶胶用去离子水（Millipore 18 MΩ），其余用水均采用二次蒸馏水。 ? ?1.2 纳米银胶的制备 ? Millipore 18 MΩ）荡洗几次。银溶胶的制备方法参见文献[5]，即将30 ml 1.5×10-3 mol/L NaBH4溶液置于冰浴中，在剧烈搅拌下，分批滴加入10 ml 1.0×103 mol/L AgNO3溶液，继续搅拌1/2 h，制得的溶胶呈黄色透明状，在4 ℃下可稳定保存约1个月。用原子力显微镜对银溶胶粒子的形状和大小进行了表征，结果显示银溶胶粒子呈球状，均匀地分布在溶胶中，其纳米银粒子的尺寸在8～15 nm之间。 ? 1.3 纳米银胶标记DNA探针的制备 ? SH-ssDNA溶解在新制备的银胶溶液中，SH-ssDNA的浓度为1.0×10-5 mo1/L，室温下静置20 h，使SH-ssDNA与纳米银胶颗粒充分发生自组作用。然后将该溶液在15 000 r/min下高速离心30 min，除去上层清液，用磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀，再离心分离，以除去未反应的过量寡聚核苷酸，所得的探针用磷酸盐缓冲溶液稀释成一定的浓度，于0～5 ℃保存，备用。 ? 1.4 待测DNA在玻碳电极上的固定 ? [7]，将玻碳电极用0.05 mm Al2O3粉末在麂皮上打磨至光亮，并依次在丙酮、1:1 NaOH溶液、1:1硝酸溶液以及二次蒸馏水中超声清洗。采用三电极体系，把电极插入含有0.1 mo1/L KCl和0.05 mo1/L吡咯溶液中，以50 mV/s 的速度在0～+0.7 V的电位范围内循环伏安扫描15圈后，在电极表面形成一层均匀的薄膜，吡咯被电化学聚合到电极表面。取出电极，把它浸入到待测DNA溶液中，在+0.5 V恒电位下吸附200 s，通过静电作用，DNA被固定在聚吡咯修饰的玻碳电极表面。电极用KCl溶液冲洗后以除去多余的未固定的DNA。 ? 1.5 杂交反应 ? DNA片段的玻碳电极同时浸入到依据上述1.4制得的纳米银胶标记DNA探针溶液中进行杂交反应，40 ℃下均匀搅拌1 h。取出后，清洗除去表面吸附的未杂交的纳米银胶标记探针。 ? 1.6 银的氧化溶解及测定 ? 50%的HNO3溶液中，振荡