细菌的染色技术及微生物大小的测定实验四.docVIP

实验四 《细菌的染色技术及微生物大小的测定》 标准实验报告 适用专业： 环境工程 江苏科技大学学院2012年 月 第一部分 微生物的染色技术第二部分 微生物大小的测定一、实验目的1. 加深对微生物的染色原理的理解、熟悉并掌握染色的基本操作技术，重点掌握微生物的革兰氏染色法； 2．熟悉目测微尺和物测微尺的使用方法，掌握测定微生物大小的技能。 3．巩固光学显微镜的使用方法 二、实验要求 1．预习有关细胞染色等方面的知识； 2．遵守实验室安全制度，听从指导教师安排； 3．认真听讲，不懂就问； 4．完成实验报告 三、实验仪器和材料 1．仪器：光学显微镜、载玻片、接种环、酒精灯（或煤气灯）、培养皿、擦净纸、标签纸、吸水纸 2．材料：无菌水、二甲苯、香柏油（或液体石蜡）、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液、石炭酸复红（品红）染液 3．菌种：上次学生实验培养的细菌斜面种、E.coli 目测微尺、物测微尺、光学显微镜、微生物标本片原理微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测定，细菌等电点在pH=2-5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH7）或偏酸性（pH=6-7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红，孔雀绿和蕃红等。 微生物体内部结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。 复染色法：指用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。它的染色步骤为：先用草酸铵结晶紫染色，经碘—碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色者叫革兰氏阳性菌，被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。μm）。它并不直接测细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。 五、实验步骤及内容 1．制片 （1）涂片：取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种（大肠杆菌或枯草杆菌）与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。（注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可。） （2）干燥：最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。 （3）固定：将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2—3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。 2．用草酸铵结晶紫染液染1min，水洗。 3．加革氏碘液媒染1min，水洗。 4．斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30s至45s，水洗。） 5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。．目测微尺的标定 将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上使刻度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长度。 ．菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和宽度。 、实验结果 大小：标数：3×1 大肠杆菌大小：实际：1.82um×0.91um 标定 目镜 物镜 数据结果 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)球型，直径0.8 um左右；大肠杆菌大小0.4~ 0.7×1 ~3um；枯草芽孢杆菌单个细胞0.7～0.8×2～3um;染色关键必须严格