聚合链变酶基础知识.doc

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 目录 概述 PCR原理 PCR反应体系与反应条件1.标准的PCR反应体系 2、PCR引物设计 3、模板的制备 4、PCR反应条件的控制 PCR的循环参数1、预变性（Initial denaturation） 2、循环中的变性步骤 3、引物退火（Primer annealing） 4、引物延伸 5、循环数 6、最后延伸 PCR步骤1.DNA变性 2.退火 3.延伸 PCR检测 PCR反应特点特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 PCR仪器 PCR常见问题 PCR实验室的建立方法1、实验室布局 2、设置标准 概述 PCR原理 PCR反应体系与反应条件 1.标准的PCR反应体系 2、PCR引物设计 3、模板的制备 4、PCR反应条件的控制 PCR的循环参数 1、预变性（Initial denaturation） 2、循环中的变性步骤 3、引物退火（Primer annealing） 4、引物延伸 5、循环数 6、最后延伸 PCR步骤 1.DNA变性 2.退火 3.延伸 PCR检测 PCR反应特点特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 PCR仪器 PCR常见问题 PCR实验室的建立方法 1、实验室布局 2、设置标准 概述 　　DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow 　　fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase),则是 聚合酶链式反应示意图 [1] 于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 PCR原理 　　DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 　　发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大 taq酶 [2] 量应用，并逐步应用于临床。 　　PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR反应体系与反应条件 1.标