TTC肉汤二倍稀释法测MIC讲义.pptVIP

几种抗菌药物的最小抑菌浓度的测定－－MIC试验 （微量肉汤二倍稀释法） 一、目的 1、掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤，能准确测出各种抗菌药物的MIC值，了解单药的抗菌活性 2、为后面的棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘的中心浓度 二、意义 1、通过对MIC值的测定了解药物的体外抗菌活性 2、为临床选药提供依据 3、耐药检测 三、菌种 1、大肠杆菌（标准菌株25922） 2、沙门氏菌（标准菌株） 3、金色葡萄球菌（标准菌株） （以上三种菌株均由中国兽药监察所提供） 四、药品 硫酸庆大霉素（批号： 含量： 厂家： ） 阿莫西林（批号： 含量： 厂家： ） 硫酸四环素（批号： 含量： 厂家： ） 恩诺沙星（批号： 含量： 厂家： ） 阿米卡星（批号： 含量： 厂家： ） 氟苯尼考（批号： 含量： 厂家： ） 五、培养基 MH肉汤培养基、用去离子水配制5g/L显色剂TTC（氯化三苯四氮唑） 六、器材 96孔细胞培养板、培养皿、移液枪、 1ml和200 μl枪头、EP管、锥形瓶、试管架、酒精灯、酒精棉球等 分析天平、超净工作台、37度恒温培养箱、烘箱 七、方法步骤 1、药液的配制及除菌 配制 根据药物的效价或是含量及所需要的体积，计算出药物所需的量，并准确称取所需的各种抗菌药物，用适宜的溶剂及稀释及稀释剂将药物稀释至所需的浓度。 除菌 抗菌素药物通过过滤的方式过滤；化学合成类药物通过过滤或是高压灭菌的方式进行除菌。 2、不同的抗菌药物原液配制所需的溶剂 溶剂为PH4.5PBS缓冲液的：四环素类 溶剂为PH6.0PBS缓冲液的：青霉素G，半合成青霉素类，头孢菌素类，多粘菌素B硫酸盐 溶剂为PH7.8PBS缓冲液的：氨基糖苷类，林可或氯林可霉素 3、MIC的测定（微量二倍稀释法） 第一步：在96孔板每个孔加入含TTC的空白肉汤100μl 。 图表 第二步：在A/B/C三排的第一孔加配好的药液A(浓度为512IU/ml或μg/ml)100 μl，然后对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少三次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，吸取100μl弃去;此时每孔药物浓度从左到右依次为：256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125(单位:IU/ml或μg/ml) 图表 第三步：再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl,这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复（A/B/C三排样品）。此时每孔药物浓度即最终药物浓度从左到右依次为： 128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06(单位:IU/ml或μg/ml)； 图表 第四步：在同一块板上的G排上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和在H排上做一排阳性对照（加菌液不加药液） 第五步：将96孔板放入37度恒温培养箱16～20小时后，观察结果。 图表 第一步 第二步 第三步 第四步 八、观察及判断结果 1、若有菌生长TTC会显示红色；若没有细菌生长TTC则不变色。 2、MIC值的判定：96孔板上横排中未变红色的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。 3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果 4、记录结果并将每种药物的MIC值报告老师 九、注意事项： 1、无菌操作 ① 除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理 ② 超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒；不能拿酒精面球球擦挡板！ ③ 操作前洗手，用酒精棉球擦手 ④ 每次枪头过瓶口，瓶口都要经火焰烧过；移液枪和枪头不能在究竟灯上烤！ ⑤ 操作过程中加液尽可能不将96孔板盖