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一、章（节、目）授课计划 第 页 授课章节名称 第三章 细胞生物学研究方法 授课 时数 2 教 学 目 的 1、使学生掌握细胞形态结构的观察方法，了解主要工具侧重掌握基本原理和基本应用1、掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养 3、了解细胞工程技术 教 学 重 点 1、细胞形态结构的观察方法 2、细胞组分的分析方法及细胞培养。。 讲授法、 互动讨论法 作业与 思考题 部分课后作业 阅读 书目或参考 资料 1、《》(翟中和等)(高教出版社)《》《》A、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本， 放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。  显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学 教 学 内 容 小结 显微镜 。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。 三、光学显微镜技术 光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。 （一）普通复式光学显微镜技术 1. 构成： ①照明系统：光源、折光镜、聚光镜 ②光学放大系统：为两组玻璃透镜，目镜与物镜 ③机械装置和支架系统，由镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋等部件组成，保证光学系统的准确配置和灵活调控。 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 教 学 内 容 小结 （二）相差和微分干涉显微镜技术 光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，提高了各种结构间的对比度，明暗差别通过密度差形成 使各种结构变得清晰可见。用途：观察未经染色的玻片标本，样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。 教 学 内 容 小结 （三）荧光显微镜技术 特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片（激发光滤片，阻断滤片） 照明方式通常为落射式（这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是适用于非透明物体检出能力高；对细胞的刺激小；能进行多重染色。 间接免疫荧光标记技术 （四）激光共聚焦显微技术 原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点（所谓共焦，是指物镜和聚光镜同时聚焦在同一点上），也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。　　激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也