培养基种类及成分对核桃叶片组织培养褐变的影响.docVIP

培养基种类及成分对核桃叶片组织培养褐变的影响 　　摘要：以核桃叶片为试材，探讨了不同培养基种类和某些培养基成分对其离体培养褐变的影响。结果表明：核桃叶片外植体在MS纸桥培养基上培养10天发生褐变率较低，1/2MS次之，MS、B5和N6培养基外植体褐变率最高。添加200～500毫克/升柠檬酸可有效减轻外植体褐变；添加2000～2500毫克/升活性炭对褐变有作用但没有柠檬酸效果好；而抗坏血酸对减轻外植体褐变无显著作用。 　　关键词：核桃；外植体；褐变；培养基 　　基金项目：甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室项目（项目号XZ1003） 　　中图分类号： S664.1 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.031 　　核桃（Juglans regia）是世界四大干果之一。目前世界核桃年产量92万吨，我国年产30万吨，占世界三分之一 [1]。核桃味甘、性温，可补肾、固精强腰、温肺定喘、破血祛瘀、润燥滑肠、补虚强体，提供营养、消炎杀菌，养护皮肤、防癌抗癌、补脑。植物组织培养技术在众多植物良种繁育上的成功应用为核桃良种的快速繁殖提供了一条有效途径[2，3]。王娟[4]等认为适当缩短转瓶周期可抑制金薄香核桃茎段外植体褐变的发生。章铁[5]等采用褐变抑制剂能明显抑制大别山山核桃不同树龄及不同部位的茎尖褐变。张小红[6]等在培养基中加入核桃硫代硫酸钠能防止褐变，并提高该种基因型核桃外植体萌芽率和新梢率。许传俊[7]等认为不同类型培养基对外植体的分化会产生不同的影响。尚旭岚[8]等认为采用液体培养基可有效克服鹤望兰外植体褐变。梅兴国[9]认为培养基中无机盐含量越低，外植体发生褐变程度越低，培养基中无机盐浓度过高，可导致细胞褐变。 　　利用组织快繁技术，加速良种及其砧木无性苗的繁育，具有很高的商业价值。然而在核桃组织培养中，外植体一般在接种后就出现褐变，最后导致外植体褐变死亡，因此难以建立无性繁殖体系[10，11]。因而，在核桃离体培养中，防止外植体褐变死亡是其能否培养成功的关键。本试验以核桃叶片为研究对象，研究培养基的种类及成分对核桃叶片褐变的影响，为核桃快速繁殖和组培提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1供试材料 　　参试核桃叶片采摘于甘肃河西学院。试验于2013年9月至2014年12月在河西学院农业与生物技术学院植物组织培养室进行。 　　1.2外植体的灭菌 　　先用流水冲洗30分钟，再用75%的酒精浸泡10分钟，然后用0.1%的升汞浸泡3分钟，最后再用无菌水冲洗3～5次后，放在无菌水中备用。 　　1.3培养基种类对外植体褐变的影响 　　分别配制MS、1/2MS、MS纸桥培养基、B5和N6培养基。以MS为对照。每种培养基接种数为50个，每天观察外植体情况，记录开始发生褐变的外植体数以及褐变程度。外植体的褐变率（%）= 褐变的外植体数/总外植体数×100。 　　1.4抗氧化剂和吸附剂的作用 　　配制以下培养基：MS；MS + 200毫克/升柠檬酸；MS + 500毫克/升柠檬酸；MS + 1000毫克/升柠檬酸；MS + 5毫克/升抗坏血酸；MS + 10毫克/升抗坏血酸；MS + 20毫克/升抗坏血酸；MS + 1500毫克/升活性炭；MS + 2000毫克/升活性炭；MS + 2500毫克/升活性炭。 　　2 结果与分析 　　2.1培养基种类对核桃叶片外植体褐变的影响 　　表1 不同培养基对核桃叶片外植体褐变的影响 　　由表1可见，核桃叶片外植体用MS纸桥培养基培养的褐变率最低，培养10天尚未发生褐变，褐变率为0；在1/2MS培养基的褐变率次之，培养10天后34个发生褐变，褐变率为68%；而在MS、B5和N6培养基的外植体褐变率最高，培养10天全部发生褐变，褐变率为100%。 　　2.2抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响 　　表2 抗氧化剂和吸附剂对核桃叶片外植体褐变的影响 　　由表2可见，核桃叶片外植体在添加了抗坏血酸培养基中培养，褐变发生与对照没有明显差别，培养10天外植体基本全部褐变。培养基中添加活性炭，外植体出现黄化，培养10天也大部分褐变，但浓度为2000毫克/升或高于2000毫克/升时，可以较明显地减轻褐变的发生。与对照相比，培养基加入柠檬酸，外植体褐变减轻。 　　3 讨论与结论 　　3.1培养基类型对核桃叶片外植体褐变的影响 　　不同类型培养基对外植体的褐变程度会产生不同的影响。本研究结果表明，核桃叶片外植体在 MS、B5和N6培养基上的褐变发生均较为严重，而在1/2MS培养基上外植体褐变较轻，可能与1/2MS无机盐浓度较低有关。这与前人的研究结果一致，有人认为过高无机盐浓度会引起某些植物外植体中酚类