【2017年整理】徐李圣开题报告定稿.docVIP

武汉生物工程学院 毕业论文(设计)开题报告 题 目 名 称 野生食用菌凝集素的筛选及活性检测 题 目 类 别_ __ _ 毕业论文______________ 系 别__ __生物技术______________ 专 业 班 级___08级生物技术系本科一班___ 学 生 姓 名_________徐 李 圣_______________ 指 导 教 师________ 邓 政 东_______________ 辅 导 教 师________邓 政 东______________ 开题报告日期_____ 2011年6月25日__ _____ 研究现状： 蕈菌（mushroom）又称伞菌，作为生物名称通常译作蘑菇，是指那些能形成大型肉质子实体的真菌，包括大多数担子菌类和极少数的子囊菌类，其富含蛋白质和氨基酸，具有降低胆固醇、增强免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老等医疗保健作用[1]。 凝集素（Lectin）是自然界广泛存在的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于免疫反应的糖蛋白，它能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共价结构。凝集素具有众多的生物活性，如凝集细胞的作用，免疫反应，细胞毒作用，作用于变异细胞以及发育细胞等，它已成为生物科学和临床科学非常有用的研究工具，并应用于临床诊断及治疗等。凝集素从发现至今已有100多年的历史，自从1888年俄国学者首次在蓖麻籽中发现凝集素后，凝集素的研究一直继续。1919年Sumner从豌豆中分离出结晶蛋白，命名为ConA，并用此方法第一次获得了纯的凝集素。1936年Sumner和However报道了ConA可以凝集血细胞和酵母细胞，也可以在溶液中沉淀糖原。蕈菌凝集素早在上世纪60年代至70年代，已对超过600 种高等真菌的提取物进行了测定，发现约30%具有凝集红细胞的活性。1994年Pemberton测定了403种采集于英国的蕈菌，发现约50%的蕈菌子实体提取物对人的红血球有凝集作用。越来越多的研究表明，凝集素是药用真菌中重要的药理成分[]。食用菌凝集素的来源极其广泛，到目前为止，已经发现存在凝集素的食用菌包括双孢菇，金针菇，灵芝，香菇，牛肝菌等等，其中多数存在于菌类子实体中，而有的则在发酵菌丝体，实体中都有分布。不同菌种来源的凝集素其结构组成，分子量，对糖血细胞的专一性，等电点等物化性质都会有所差异。 目前，蕈菌凝集素研究的较少，全世界已经纯化的凝集素约有100多种，研究发现，大多数大型真菌凝集素具有很强的抗肿瘤活性。如双孢蘑菇凝集素具有抑制结肠癌细胞株HT29 、Coca22和乳腺癌细胞株MCF27的活性，金针菇、灵芝、口蘑凝集素具有抗肿瘤和免疫调节生理活性。为此，扩大筛选食用菌凝集素，研究其性质，可以更好地为食用菌产品的开发应用提供科学依据。DEAE2Sepharose FF 层析柱(116 cm ×20 cm)，0.15 mol/ L NaCl 的PBS 进行线性离子梯度洗脱， （五）按CBB - G250 法，1、蕈菌凝集素提取取新鲜的蕈菌子实体 50g，洗净，剪碎，用PH72 0。05mol/L磷酸缓冲液（含014mol/L NaCl，称PBS）于4℃冰箱中浸泡24h，再经高速捣碎机捣烂后，4层纱布过滤，滤液3500r/min，离心30min，取上清液加入不同饱和度的硫酸铵沉淀（20%-70%），于4℃冰箱中静置过夜，离心同前。将收集到的沉淀物溶于PBS溶液，并以同一缓冲液透析至无(NH4)2SO4，风干浓缩即为食用菌凝集素粗品，备用。 2、测定 （1）血细胞的采集与处理，配成2%细胞悬液。 测定在96孔“V”型血凝板中加入PBS25μl，取样品25μl作倍比稀释。每孔中加入25μl 2%红细胞悬液，振荡均匀，室温放置15h后观察结果（20-70%梯度）。凝集素活力以产生血凝作用所需的最低凝集素浓度（微克/毫升）或最低浓度的倒数（微克/毫升）表示，亦可用凝集素样品的稀释倍数即效价表示。 3、蕈菌凝集素分离纯化 50 mL 上DEAE-Cellulose 柱，用不同盐浓度的PBS 溶液(002 mol/L 磷酸缓冲液（pH 72)洗脱，在280 nm 的波长下检测，并记录下各个洗脱峰，洗脱峰用兔红细胞检测其凝血活性。活性部分收集， 浓缩后上Sephadex G-100柱进一步纯化，洗脱液仍用002 mol/L 的PBS洗脱， 同法检测，收集活性部分的洗脱液，用蒸馏水透析除盐，冷冻干燥，得到香灰菌凝集素纯品。分组做凝血鉴定，选出效果最好的一组利用考马斯亮蓝测定蛋白质吸收峰。 4、按