食品酶学第四章酶的稳定和固化.docVIP

第四章 酶的稳定性和固定化 第一节 酶稳定的分子原因 ◆ 稳定蛋白质构象的力（盐键、氢键、二硫键和疏水作用）。 金属离子、底物、辅助因子和其他低相对分子量配体的相互作用使酶蛋白构象稳定。 金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是拐弯处），可以显著增加酶的稳定性。 蛋白质与其它的生物大分子尤其是蛋白质与脂的作用。 在生物体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用形成复合物，屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋白质的稳定性。 氨基酸残基的坚实装配 蛋白质分子中存在约25%的体积的空隙，这些空隙通常为水分子所充满。由布朗运动调节的极性水分子与蛋白质疏水核的接触会导致蛋白质不稳定。 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 活性部位的氨基酸残基的氧化作用是酶失活的最常见机理之一。如半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别敏感。 第二节 酶不可逆失活的原因和机理 蛋白质水解酶作用 微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽键水解。由基因工程菌纯化真核细胞多肽时收率低，是由于体外蛋白水解造成的。 聚合作用 聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂，导致蛋白质可逆变性；其次，蛋白质分子彼此缔合，以减少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发生分子间二硫键交换反应。聚合作用有时可通过还原和再氧化再生天然二硫键，使蛋白质再活化。聚合和简单沉淀是有区别的，后者并未使蛋白质发生显著的构象变化。 极端pH 极端pH条件下，一旦远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内相同相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展，埋藏在蛋白质内部的非电离残基会电离，这些构象变化能导致不可逆失活。另外，强酸条件下或中等pH和高温相结合的条件下，肽键容易发生水解。碱催化的β-消除反应可破坏蛋白质的二硫键。 氧化作用 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、过氧水和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。 表面活性剂(去污剂) 阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质结合时导致蛋白质伸展，使原先埋藏的疏水氨基酸暴露，有利于SDS的进一步结合，直至达到饱和为止，SDS聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。对于所有蛋白质来说，每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。 阳离子去污剂也能结合蛋白质，而它的临界胶束浓度（CMC）是SDS的10倍，因而，蛋白质更能抵抗阳离子去污剂的变性作用。非离子去污剂如Triton X-100通常不能使蛋白质变性。 变性剂（脲和盐酸胍、高浓度盐、螯合剂、有机溶剂） 高浓度脲（8-10 M）和盐酸胍（6 M）常用于蛋白质变性，但准确的作用机理不太清楚。有两个特点：这些试剂消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作用的疏水相互作用；它们直接与蛋白质分子作用。 高浓度的盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用。(CH3)4N+ NH4+ K+ Na+ Mg2+ Ca2+ Ba2+ SO42- Cl- Br- NO3- ClO4- SCN- 越靠近左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强，通过盐析疏水基团，使蛋白质分子更坚实更稳定。靠右侧的离子能结合于蛋白质的带电基团或结合于蛋白质肽键的偶极子，降低蛋白质周围的水簇数目，引起蛋白质盐溶，降低蛋白质构象的稳定性。 结合金属离子的试剂，如EDTA能与金属离子形成配位复合物，使酶失去金属辅因子，导致酶活性不可逆丧失。对于不需要金属离子的酶，螯合剂可稳定其活性。 酶可在水溶液或无水有机溶剂中发挥作用，但在与水混溶的有机溶剂中失活。与水混溶的有机溶剂能夺取酶分子表面的必需水，从而使酶失活。 重金属离子和巯基试剂 重金属阳离子如Hg2+、Cd2+、Pb2+能与蛋白质的巯基反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反应。此外银或汞能催化水解二硫键。 巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但通常是可逆的。 热 热失活是最常见的蛋白质失活方式。酶可逆伸展使它的反应基团和疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。 机械力 机械力（压力、剪切力、振动）和超声波能使蛋白质变性。 冷冻和脱水 低温减弱了疏水相互作用，引起蛋白质的解离和变性。冷冻过程中，蛋白质随着水分子结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈变化，从而引起寡聚蛋白质的解离。还有一原因是二硫键交换和巯基氧化。酶的冷冻和失水是相似的。 辐射作用 电离辐射（如X射线、γ射线、电子、α粒子）由于形成自由基引起蛋白质一级结构的改变，导致天然构象丧失或