蛋白质组分析中mutans链球菌酸碱代谢表型.doc

蛋白质组分析中mutans链球菌酸碱代谢表型 爱丽丝,德里克·林之Harty和尼古拉斯·a .雅克 牙科研究所,Westmead千年研究所和Westmead口腔保健中心、宝箱、新南威尔士、533、Wentworthville 2145澳大利亚 摘要 二维凝胶电泳分析蛋白质的mutans链球菌生长在一个稳定的状态glucose-limited厌氧连续大量的蛋白质,揭示了不同的表达当增长了降低pH值7?从0到pH值五?0。在表达的变化通常是限于蛋白质代谢生化途径:糖酵解作用,三酸的生产,选择branched-chain氨基酸的合成。相关的蛋白表达 　缩写:2-DGE、二维凝胶电泳技术;ASB-14,amidosulfobetaine-14;D、稀释剂、微分表达式;德(价值)、肺、固定化pH值梯度;IPS,细胞内的多糖,MALDI-TOF,matrix-assisted激光解析电离飞行时间;PEP-PTS、磷酸葡萄糖phosphotransferase系统;PMM:大众映射,YATP、肽,ATP产量、干重、YGlc细胞组分ATP产量、干重、细胞的细胞组分葡萄糖 　　开始龋齿cl 大量的研究一直致力于研究,特别是链球菌糖类新陈代谢的生理生化、mutans产酸允许s和生存在低pH值在口腔。从历史上看,这个研究已经雇了一个简化方法研究生物化学过程的监管等构酶和改造的通量的代谢物(Iwami 山,1980年,汉密尔顿,1984年,山田,1987;Carlsson和汉密尔顿,1996;Quivey等,2001年)。 在目前的研究中,蛋白质的s . mutans,生长在稳态在pH 7?0人工唾液中,定义了已经相比,细胞生长在pH值五?0。该方法已被选来模拟条件的牙菌斑和健康的个体相比,更容易的主人。同时,从某种程度上来说,本文分析了表型的适应程度,在酸性容忍它显示变动而变动的表达生长和菌株的条件。 　　mutans LT11连续文化葡萄球菌(道等,1993)生长在厌氧条件下在稀释比率(D)为0??001 h-1 100±0,pH 7??1或0±0在pH值五??1 0±0与葡萄糖的营养,如前述(雅克等,1979年)。采用数字媒体,没有黏液,但是修改包括尿嘧啶、鸟嘌呤、腺,年方二十,实已垂垂老矣μg ml-1 15毫米,KH2PO4和15毫米K2HPO4(席森斯等,1991)。分析表明,mutans葡萄糖有限是. .) 准备对细胞内蛋白质。 　　当稳态已经达到,细菌培养容器的内容获得大丰收,清洗和冻干前,aliquots(10毫克的干重的细胞)和mutanolysin(林等,2003年)。蛋白质能被分离对酸性固定化pH值梯度(1986)条(pH 4??7)中提取0-6如(林等,2003年),除了1%(w / v)amidosulfobetaine-14 65毫米(ASB-14)和金红石被加入产生一种改性solubilizi 蛋白质在基本分条(pH 6-11观测得到mutanolysin-treated)是由一个two-fraction细胞增程序。以下的细胞lysate离心(12万4°C,10分钟),细胞颗粒被储存在- 20℃和蛋白质沉淀在浮在一夜之间是有15 - 20°C的%(w / v)trichloroacetic酸。下列离心法(12万4°C,10分钟)和两个洗在甲醇、沉淀蛋白在300μl之前进行的 　　2-DGE。 　　摘要为了分离酸性,相当于2-DGE蛋白质的细胞蛋白提取0?重量75毫克干电池溶解在150μl修改2-DGE-solubilizing前,在解决cup-loading?0-5提出了窄(pH四4???5-5 0,5-6??五5条(7)肺Amersham生物),pre-swollen以350μl相同的修改2-DGE-solubilizing解决方案。为基本的细胞内蛋白质、肺条(pH 6-11;Amersham)第pre-swollen生物改性2-DGE-solubil 蛋白质都集中使用Multiphor II电泳系统(Amersham 20°C的生物)。蛋白质都集中在提出了窄肺条共5 kVh 141?7小时(100个V,紧随其后的是300伏特为6小时为2小时,1000 V 2小时,2500 V,3500 V 2小时和5000 V 25小时),在broad-range肺条共79?kVh 8(100 V 2小时,其次是300伏特2小时为2小时,1000 V 2小时,2500五12小时,3500 V和5000 V为6小时)。之后在第二层面分离10-18 % T g 体积密度、微分表达式。/(德)值(任意单元),每Sypro Ruby-stained测定蛋白质现场运用软件包z3(电脑基因公司合作)。在这项研究中,主要