分子克隆常用载体.pptVIP

pSC101是一种严谨型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1-2个拷贝，分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因。pSC101质粒载体是第一个成功地用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。将带有非洲爪蟾核糖体基因的EcoRI DNA片段，连接到pSC101复制子上。 ColE1质粒是属于大肠杆菌Col类质粒中的一种。由于携带着Col质粒的许多细菌，都能产生一种叫做细菌素的物质，所以Col质粒又被叫做细菌素质粒。属于松弛型复制控制的多拷贝质粒，用它做基因克隆的载体，可以克服pSC101质粒载体的低拷贝、低产量的缺点。 pBR322第一个优点是具有较小的分子量，第二个优点是具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。第三个优点是具较高的拷贝数，经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000-3000个拷贝。 与pBR322质粒载体相比，pUC质粒载体具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中最通用的大肠杆菌克隆载体之一。第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数。第二，适用于组织化学方法检查重组体（pUC质粒中含有lacZ基因，可用Xgal显色法筛选重组子）。第三，具有多克隆位点MCS区段。 pUCm-T Vector是在pUC19 Vector的基础上改造而成。除多克隆位点外，其余序列同pUC19 ①吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上；②注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入宿主细胞;③转变：被感染的细菌细胞功能发生改变，成为制造噬菌体颗粒的场所；④合成：寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白；⑤组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒，这个过程也叫噬菌体的形态建成。⑥释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。 cI阻遏基因编码的阻遏物与操纵基因结合，使RNA聚合酶无法使用启动子进行转录。这种状态有充分的能力使原噬菌体保持关闭的状态，这就是溶源性细菌能不停生长而不发生溶菌裂解的原因所在。 这两种不同的λ噬菌体派生载体具有不同的特点，因此在基因克隆中的用途也不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA的插入，广泛应用于cDNA和小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA的插入，所以适用于克隆高等生物的染色体DNA。 野生型的λ基因组中，编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。 根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的原理。 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，在颗粒中包装的仅是（+）链的DNA。当感染的M13噬菌体颗粒穿过性须是，其外层主要外壳蛋白质便会脱落，余下的M13（+）链DNA进入到大肠杆菌寄主细胞内。进入细胞内部的M13（+）链DNA起到模板的作用，在宿主胞内酶的作用下，合成出互补的（-）链DNA。几轮复制后，基因II的产物便在RF DNA的正链特定位点上作切割反应，形成一个缺口。新合成的（+）链DNA便会被切除下去，环化形成单位长度的M13基因组DNA。 实验发现，一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。因此，假若柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性记号及相容性的复制起点，那么当它们转化到同一寄主细胞之后，便可容易地筛选出含有两个不同选择记号的共合体分子。 分子克隆常用载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯载体 酵母细胞的克隆载体 一、质粒载体 理想的质粒载体必须具备的基本条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因 3、具有若干限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较多的拷贝数 重要的大肠杆菌质粒载体 pSC101质粒载体； ColE 1质粒载体； pBR322质粒载体； pUC质粒载体； T载体 pUCm-T质粒图谱 pUCm-T载体序列 二、噬菌体载体 噬菌体的生命周期 （1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体） （2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体） （1）烈性噬菌体的生活周期 （2）温和噬菌体的生活周期 裂解循环 溶源态 重要的噬菌体载体 一、λ噬菌体载体 （1）插入型载体：有单一酶切点,便于外源DNA插入 （2）替换型载体，具有成对的克隆位点，在这两个位点之间λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代 λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。 注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 36kb ~ 51kb。 体外包装：λ噬菌体载体 + 尾部蛋