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第二章 微生物的觀察與檢驗 顯微鏡構造及使用 微生物染色 微生物鑑定 第一節　顯微鏡構造及使用 顯微鏡的種類與功能 顯微鏡若依觀察方法的差異性，則可區分為明視野顯微鏡、暗視野顯微鏡、位相差顯微鏡、干擾相差顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外光顯微鏡、螢光顯微鏡、雷射共軛焦顯微鏡、解剖顯微鏡與電子顯微鏡等特定功能之顯微鏡。 光學顯微鏡 原理 光學顯微鏡是由二組凸透鏡（物鏡、目鏡）組成。欲觀察的物體先經物鏡聚成一放大的倒立實像，該倒立實像於顯微鏡成像過程中僅屬於過渡性的影像，此倒立實像恰巧落於目鏡的焦點內，所以當人眼緊靠目鏡的出視孔時，可觀察到倒立實像經目鏡放大後的更加放大之倒立虛像。 放大率 顯微鏡的放大功能原理是將物鏡和目鏡做適當地調整組合，以放大欲觀察物體（標本）之影像。 物鏡的功能為使被觀察物體成一個倒立放大的實像。低倍鏡常用於搜索觀察對象及觀察標本全貌，高倍鏡則用於觀察標本某部分或較細微的結構，油鏡則常用於觀察微生物或動植物更細微的結構。 目鏡的功能則是將物鏡形成的實像再一次放大成虛像。 顯微鏡總放大率＝物鏡之放大倍數×目鏡之放大倍數。 解像力 解像力是指鏡頭能清楚分辨二相近物體間最小距離的能力。若鏡頭中有二個物體接近到幾乎重疊時，此時通過物體的光線會產生繞射，進而在物體周圍產生一系列光圈，使得二物體無法被清楚辨識，此即表示鏡頭對該二物體已失去解像力。 顯微鏡解像力可由下列數學公式表示： 式中D值愈小，表示顯微鏡的解像力愈好，亦即物體可視的二點最短距離很小時仍可以被辨識。由式(1)可知，顯微鏡解像力與入射光波長、光入射角、介質的折射率有關。 入射光光源波長：λ值愈大，D值愈大；λ值愈小，D值愈小，亦即入射光波長愈長，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；入射光波長愈短，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。 光入射角：sinθ值愈小，D值愈大；sinθ值愈大，D值愈小，亦即光入射角愈小，顯微鏡辨識物體的解像力愈差；光入射角愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。 顯微鏡解像力有實質幫助的光入射角度最大值僅為140°。 介質的折射率：n值愈小，D值愈大；n值愈大，D值愈小，亦即標本與物鏡間介質的折射率愈小，顯微鏡辨識物體之解像力愈差；標本與物鏡間介質的折射率愈大，顯微鏡辨識物體的解像力愈好。 數值孔徑(numerical aperture)：亦稱光口徑，是表示經由聚光鏡至物鏡所產生錐狀光圈的量度。 電子顯微鏡 電子顯微鏡與光學顯微鏡的原理極為相似，差異在於電子顯微鏡以電子束取代光線，電磁鐵透鏡取代玻璃透鏡，由於電子輻射的波長比可見光小很多，故大幅提昇解像力（普通光學顯微的最小解像距離為0.2μm，電子顯微鏡可達到0.001μm，亦即10　）。 Ａ 光學顯微鏡 明視野顯微鏡 暗視野顯微鏡 位相差顯微鏡 螢光顯微鏡 光學顯微鏡 明視野顯微鏡 明視野顯微鏡是以自然光或鎢絲燈（電燈）為光源照射樣本，通過與未通過樣本之光線皆進入物鏡中，使得樣本本身呈陰暗，視野背景為明亮狀態。 暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡與明視野顯微鏡相似，皆利用可見光為光源照射樣本，唯一差異在於暗視野顯微鏡的聚光鏡中央有暗視環，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被樣本散射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景為陰暗，物體的邊緣為明亮。 位相差顯微鏡 位相差顯微鏡利用菌體內各部位密度的差異，進而對入射光線產生不同的散射，使得活細胞內不同部位產生明顯對比，藉此辨別活細胞內各種構造。位相差顯微鏡較普通光學顯微鏡多了環狀光圈與位相板（位相移動片）等構造。 螢光顯微鏡 螢光顯微鏡是藉由樣本發出的光來達到觀察之目的。某些物質經激發光照射後會產生螢光，無法產生螢光的物質亦可利用螢光染劑與欲觀察的物質結合後產生。螢光顯微鏡包含光源、激發濾光片、螢光樣本與阻斷濾光片等基本元件。 電子顯微鏡 掃描式電子顯微鏡 穿透式電子顯微鏡 掃描式電子顯微鏡 掃描式電子顯微鏡主要用於用來觀察樣本的表面結構。以掃描式電子顯微鏡觀察微生物菌相時須經過煩瑣之前處理過程，其過程包括菌體收集、樣本（菌體）固定、樣本脫水、臨界乾燥、鑲嵌及鍍金。 穿透式電子顯微鏡 穿透式電子顯微鏡多應用於細胞內結構之觀察。穿透式電子顯微鏡樣本製備包括樣本初步固定、樣本清洗、二次固定、脫水、過渡溶劑滲透、塑膠滲透、包埋及聚合。 電子顯微鏡 放線菌的孢子鏈 第二節 微生物染色 染色目的 染色原理 染劑 染色方法 (1)簡單染色 (2)鑑別染色 革蘭氏染色(Gram stain) 應用的溶液 反應及細菌外觀 G+ G- Time 1.結晶紫 (主染劑) 細胞染成紫色 細胞染成紫色 60 sec 2.碘液 (媒染劑) 細胞內形成CV-I複合物，紫色 細胞內形成CV-I複合物，紫色 60 sec 3