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第二章 实验室的建立与消毒灭菌技术 第一节 生物技术实验室的建立和基本设备 一、生物技术实验室的建立 标准生物技术实验室一般由以下几部分构成： ① 玻璃、塑料和其他实验器皿洗涤与贮存室。 ② 培养基准备室、灭菌和贮存室。 ③ 无菌操作室。 ④ 培养室（可以控制温度、光照和湿度等）。 ⑤ 分析和观察室。 由于离体培养技术完全是在人工控制条件下进行，实验室设计不仅要根据培养材料的要求设定适宜的温度、光照和湿度等，尤其重要的是要保持无菌的环境。实验室的整体设置既要便于各个环节的工作，又要保证便于消毒灭菌，准备室和无菌操作室应与外界隔离。 二、基本仪器设备 生物技术实验室基本仪器设备包括：各种玻璃和塑料器皿、剪刀及镊子和解剖刀等工具；天平、酸度计、离心机、显微镜、烘箱、温箱、冰箱、冰柜、摇床与转床、超净工作台、高压灭菌器、光学显微镜、倒置显微镜、实体解剖镜、荧光显微镜、分光光度计、基因枪、电泳仪、凝胶分析系统、取样器等。 第二节 消毒灭菌技术 一、玻璃和塑料器皿的洗涤与灭菌 玻璃器皿在使用之前应通过高压蒸气灭菌或干热灭菌[160(C～180(C下3 h（De Fossard，1976）]。干热灭菌的缺点是不流通和穿透慢，因此，烘箱的量要装载适当。玻璃器皿须冷却后才能取出，如果未充分冷却就取出，外部冷空气可能被吸入烘箱中，玻璃器皿将被重新污染。 新的玻璃器皿应该洗后再用。传统洗涤玻璃器皿的方法是用重铬酸钠或重铬酸钾（20 g溶于40 mL水中）和浓硫酸（360 mL）混合，浸泡4 h后用自来水冲洗。现在用清洗剂清洗玻璃和塑料器皿：先在清洗剂溶液中浸泡过夜，再用水清洗，然后用蒸馏水冲洗。如果培养瓶中琼脂干涸，应先浸泡溶化。如果已污染，不要在室内打开，应先经高压或用来苏尔溶液灭菌后再洗涤。洗后的设备在160(C下烘2 h，或180(C下烘1 h，并存放在清洁的柜子或容器中。 某些塑料实验器皿也可以干热灭菌。聚甲基戊烯（Polymethylpentene）、异质同晶聚合物（Polyallomer）、Tfzel ETFE和聚四氟乙烯（TeflonFEP）可以反复在121(C下灭菌。聚四氟乙烯器具可以干热灭菌。聚碳酸酯（Polycarbonate）反复高压灭菌会使机械强度有一定受损，灭菌一次应限制在20 min。 二、常用消毒灭菌方法 污染是离体培养中的一大障碍，在整个操作和培养过程中随时都可能发生，有时可能会造成全部材料的完全损失，甚至使培养室不经反复消毒灭菌都无法使用。由于培养基含有高浓度的糖和丰富的营养物质，不仅适合外植体生长，更适合许多微生物生长，而且微生物往往比培养的组织生长繁殖更快，并能产生对培养物有害的毒素，最终使材料死亡。由于污染来源于环境、外植体、各种器皿、工具以及培养基，主要包括：① 培养器皿；② 培养基；③ 外植体；④ 环境；⑤ 用具；⑥ 操作过程；⑦ 超净工作台，所以，组织培养的操作和培养必须在无菌条件下进行，培养室内发现污染时污染物应立即舍弃。杜绝污染源是组织培养的前提和关键。 灭菌是用物理或化学的方法完全除去或杀死器物表面和内部微生物的过程。物理方法有热力灭菌、辐射灭菌、过滤灭菌等。化学方法则采用化学药物灭菌。 1. 物理方法 （1）热力灭菌 热力灭菌是指通过加热使微生物体蛋白质凝固、酶失活而致死，致死的热力剂量为温度与时间的乘积。致死温度是指一定时间（通常10 min）内杀死某种微生物所需的最低温度；致死时间是指在一定温度下杀死某种微生物所需的时间。杀死一种微生物的热力剂量随细胞结构、组成成分和含水量而不同，如细菌芽孢内含水低，热致死量远高于其营养细胞。利用高温杀菌是最常用的灭菌方法，包括干热灭菌和湿热灭菌两种方法。 干热灭菌法：灭菌的对象是不含水、耐高温并忌湿的物品，如玻璃、搪瓷、金属器械等。被灭菌的物品必须完全干燥，在烘箱中加热至160(C并持续2 h，或180(C维持1 h，有时还应根据对象延长灭菌时间。在微生物学操作中，一些接种工具和玻璃器皿的管口常通过火焰灼烧，这也是一种干热灭菌方法。组织培养中洗净的玻璃器皿都需干热灭菌。 湿热灭菌：热蒸气的扩散力和穿透性强，可以在较短时间内达到灭菌效果。棉织品（实验服、毛巾等）、溶液、培养基和工具等都可以用湿热灭菌。在常压100(C的蒸气中，各类微生物营养体均可被杀死，但对于抗热性强的各类休眠体，常需采用间歇灭菌法和加压灭菌法才能达到彻底灭菌的目的。 间歇蒸气灭菌法：在常压流动蒸气中，分三次在连续三天内进行，适用于不耐100(C以上高温的物品和有机溶剂。每次加热至100(C并持续30 min，取出置30(C环境中培养24 h，使未被杀死的芽孢和其他休眠体萌发，在下一次加热时致死。 加压蒸气灭菌法：是组织培养中最常用和不可缺少的灭菌方法。在密闭耐压的灭菌锅中，增加