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第四章 高效液相色谱法 本章要求 ⒈ 了解高效液相色谱法的优缺点 ⒉ 了解高效液相色谱仪的结构 ⒊ 掌握常用检测器的原理及应用范围 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 ⑴ 高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。 ⑵ 高效：HPLC高压(2~6 MPa)下操作，填料颗粒小(2~50 ?m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=4000~60000 块/m)，分离效率高。 ⑶ 高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达10-11~10-13 g。 ⑷ 高自动化：HPLC进样量小(X~X0 ?L)。带有自动进样装置和工作站。 ⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效很高(理论塔板数N=104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N=103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器 与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱 GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。HPLC可进行制备，即制备色谱。 一﹑高效液相色谱仪的结构 一般分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。 工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入 色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样 品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱 柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检 测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 HPLC的系统组成 1. 高压输液系统： 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 高压泵应满足如下要求： 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。 能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。 有较高的输送压力。一般分离，6.0×104 Pa压力；高效分离，要求达到1.5~3.0×107 Pa的压力或更高。 ④ 泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种: ㈠ 恒流泵 是在一定操作条件下，输出流量恒定，与色谱柱引起阻力变化无关。 ㈡ 恒压泵 能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统阻力而变化，保留时间的重现性差。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械泵，又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。 在分离过程中，使流动相的组成、极性、pH等按一定程序连续变化，使样品中各组分能在最佳条件下出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。 通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力，梯度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。 梯度洗脱的优点： ① 改善峰形； ② 提高柱效； ③ 减少分析时间； 在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品，即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。 3. 分离系统--色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长15~30 cm，内径为4~5 mm，凝胶色谱柱内径3~12 mm，制备柱内径较大，可达25 mm 以上。 ⑴ 固定相 ① 表面多孔固定相 ② 全多孔微粒固定相 ③ 化学键合固定相 化学键合相色谱柱 虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多采用化学键合固定相。化学键合固定相是在表面多孔或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有机分子结合在载体表面。 键合类型： ㈠ 疏水基团：如C8、C18； ㈡ 极性基团：如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基(-C2H4CN)； ㈢ 离子交换基团，如阴离子交换（-NR3Cl）、阳离子 （-SO3H）；键合途径： ① Si—