5-1化学发光免疫范例.ppt

化学发光免疫分析 一、化学发光免疫分析原理 1977年，Halman建立CLIA 灵敏、无放射性污染 1.免疫分析中常用化学发光体系 二氧杂环丁烷发光体系 2.化学发光免疫相关原理 抗原、半抗原 抗体 抗原-抗体反应 3.化学发光免疫分析 化学发光免疫分析试剂：发光试剂直接标记抗原或抗体 化学发光酶免疫分析 电化学发光免疫分析 4.多种技术联用 FIA CE HPLC 微流控芯片 磁分离 二、应用 1.肿瘤标志物检测 例1. 吖啶酯标记检测肿瘤标志物 CA-125：上皮性卵巢癌的血清标志物 ACS: 180 全自动化学发光分析系统 吖啶酯标记的M11单抗为一抗 包被在磁颗粒上的OC125单抗为二抗 磁分离 H2O2启动发光 检出限10ˉ15g/mL 例2. hCG检测 ALP-Ab；FITC-Ab LP5000化学发光分析仪 ALP-Ab—Ag—FITC-Ab复合物 FITC抗体修饰磁珠 例3. CE免疫分析-化学发光检测甲胎蛋白 甲胎蛋白：肝癌标志物 HRP标记抗体（过量） 抗体与样品孵育1h CE分离 Luminol-H2O2 CE柱上发光 2.激素检测 例1.测定血浆中内皮素（ET-1) 双抗体夹心法 抗体1（与ET-1 C端结合）包被于微孔板上 加入样品和孵育缓冲 洗涤后加入HRP-抗体2（与ET-1 N端结合） 洗涤，luminol-过氧化氢体系检测 检测范围0.5 – 20 ng/L 例2.化学发光酶免疫法检测游离三碘甲腺原氨酸（T3） T3：甲状腺功能亢进首选指标 微孔板发光分析仪 T3抗体包被于微孔板上 加入样品和HRP-T3类似物，孵育45min 洗涤，加入发光底物，检测 检出限0.33pg/mL 3.心血管疾病标志物检测 例1. 肌酸激酶、肌酸激酶同工酶检测 心肌损伤标志物 对应抗体固定于毛细管内壁 样品在毛细管中与HRP-二抗反应 加入发光底物检测发光 例2. C反应蛋白-心脏病相关炎症标志物 脂质体包被Ru(bpy)33+,标记生物素，再与亲和素反应；再与生物素化抗体反应，形成抗体包被脂质体 亲和素包被磁珠与生物素化抗体反应，得到抗体包被的磁珠 两种抗体与抗原形成夹心结构 磁分离后释放出Ru(bpy)33+,ECL检测 检出限；100ng/mL 4. 传染病检测 例1. HIV检测-双抗原夹心法 5. 药物检测 例1. 地高辛均相竞争法ECL检测 地高辛-BSA-luminol与抗体结合后ECL降低 地高辛样品+地高辛-BSA-luminol复合物+地高辛抗体温育 加入过氧化氢，ECL检测 检出限2.8×10-10g/mL 例2. 氯霉素的化学发光免疫检测 检出限：0.046 ng/mL 6. 食品安全检测 例1. 间接竞争法检测黄曲霉素 自然界产生的最强的致癌物质 黄曲霉素M1-BSA固定于聚丙烯反应板上 加入牛奶样品和HRP-二抗 检出限1pg/L 例2.磁分离化学发光免疫分析检测0157:H7大肠埃希菌 单抗与磁珠偶联 加入样品中，反应30min 加入ALP-抗体 磁分离，加入AMPPD，测定光强 * * 抗原：能在机体内引起特异性免疫应答的物质。 抗体：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应抗体 Rubpy-TPA ECL体系.最常用的四类标记物：鲁米诺或异鲁米诺；吖啶酯；HRP；ALP。 hCG：人绒毛膜促性腺激素 内皮素-1：主要由血管内皮细胞分泌，调节心血管内环境稳定，血管疾病和肾衰竭症状中在血液中含量增加 竞争法 T3：甲状腺功能亢进的首选指标之一 双抗体夹心法 Luminol+过氧化氢 96孔板中，HRP标记抗原 黄曲毒素毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍 Luminol化学发光体系 发光机理 夹心法检测肿瘤标志物原理图 激素检测原理图 例3. IL-6检测 HRP标记抗体 双抗体夹心 底物邻苯二胺 2,3-二氨基吩嗪 TCPO-H2O2-咪唑发光体系 CCD成像 检出限0.5 pg/mL（血清） * 抗原：能在机体内引起特异性免疫应答的物质。 抗体：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应抗体 Rubpy-TPA ECL体系.最常用的四类标记物：鲁米诺或异鲁米诺；吖啶酯；HRP；ALP。 hCG：人绒毛膜促性腺激素 内皮素-1：主要由血管内皮细胞分泌，调节心血管内环境稳定，血