ch05稠环芳烃的高效液相色谱法分析讲解.pptVIP

海南大学环境与植物保护学院 李培征 实验五 稠环芳烃的高效液相色谱法分析及柱效能评价 实验讲解要点 一、高效液相色谱法特点和优点 二、高效液相色谱法按分离机制分类 三、反相色谱法及分离原理 四、 HPLC和GC法的比较 五、 高效液相色谱仪的基本组成 与作用 六、高效液相色谱的定性与定量 七、 使用高效液相色谱仪注意事项 八、 实验部分 HPLC有以下特点： 高压-压力可达150~300Kg/cm2。 高速-流速为0.1~10.0 ml/min。 高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单 一组分或做制备。 一、HPLC的特点和优点 二、高效液相色谱法按分离机制的不同分为： 液固吸附色谱法 液液分配色谱法（正相与反相） 离子交换色谱法 离子对色谱法 分子排阻色谱法 液液色谱法　 现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 四、反相色谱法及分离原理 正相色谱法　 采用固定相为极性的，流动相为相对非极性的疏水性溶剂 反相色谱法及分离原理 一般用非极性的十八烷基键合相（ODS）为固定相，极性的水或缓冲液中加入甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂（有机溶剂以调节保留时间）为流动相，在反相色谱法分离中极性大的化合物先留出，碳原子数少的样品先流出。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中占整个HPLC应用的80%左右。 高效液相色谱与气相色谱峰异同点 HPLC 流动相：液体 液体粘度大，扩散系数小 流动相可广泛选择，并可配成多元体系， 因此分辨率高 高效液相色谱采用5～10um细颗粒 固定相，流动相通透性小，必须用 高压输送。 应用更广，有机物75～85%可采用 高效液相色谱法进行分离。 适应于高沸点难挥发，热稳定性差的物质 高灵敏度，可检测ng/ml样品 。 GC 流动相：载气 气体粘度小，扩散系数大，流动相选择余地小 不用高压泵输送 只有25%只有有机物能用GC进行分离 适应于易挥发、较低沸点，热稳定性好的物质 灵敏度高，可检测ng/ml样品 高效液相色谱仪的基本组成 一、高压输送系统 二、进样系统 三、分离系统 四、检测系统 五、数据处理系统 色谱柱 恒温器 连接管 高效液相色 谱仪结构 色谱软件，HPLC输出接口与 色谱系统联用 检测器 进样口 注射器 进样阀 溶液储存器 高压输液泵 梯度洗脱系统 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 高效液相色谱流程示意图 一、高压输送系统 二、进样系统 三、分离系统 四、检测系统 五、数据处理系统 高压泵工作原理（单向阀） 六通阀工作原理（流路切换） 六通阀工作原理（流路切换） 高压泵工作原理（单向阀） 六通阀工作原理（流路切换） 高效液相色谱的定性与定量 定性的方法：采用保留值定性，在实验条件相同（如温度、流动相比例等）的条件下，将未知物的保留时间与已知纯物质的保留时间对比而进行定性分析 定量的方法：采用峰面积的归一化法，内标法(内标校正因子法，内标工作曲线法和内标对比法)，外标法和（工作曲线法和外标一点法）标准加入法定量。 外标法进行定量时不需要考虑校正因子，可根据试样的峰面积(Ai)和已知含量的标样中组分的峰面积(As)，求得样品的含量。 XsAi Xi(%)= ×100% As 归一化法所有组分必须在一个分析组分里面均流出色谱柱，但简便，定