ch07高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因讲解.pptVIP

海南大学环境与植物保护学院 李培征 实验六 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、液-液分配色谱 二、液相色谱的固定相 三、 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 四、液相色谱的流动相- 流动相选择时注意问题 内 容 液-液分配色谱 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 ），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 ）。正相与反相的出峰顺序相反 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。 液相色谱的固定相 化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N 一、实验目的  通过用高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因，熟练掌握采用高效液相色谱法进行定量及定性分析。 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，其分子式为C8H10O2N4，分子量为结构式： 用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 二、实验原理 三、仪器和试剂 咖啡因对照品； 待测饮料试液 流动相：20%甲醇+80%水1L。pH=3.5 高效液相色谱仪 UV检测器、 色谱柱、250mm×4.6mm 超声波发生器 50μl注射器、 容量瓶移液管等 四、实验步骤 1 标准储备液配制：用标准储备液配制质量浓度25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、125μg/ml的系列标准溶液。 2 启动泵，检测器检测波长为271nm，泵的流速为1ml/min,检测器的灵敏度设在0.08AUFS,打开色谱工作站，在计算机上启动HP在线系统，待基线稳定后开始进样。 3 将进样阀放在LOAD位时，用注射器取25μl浓度最低的标准样，注入进样阀中。 4将进样阀从LOAD位转向进样INJECT位，同时按采集数据按钮。按标准试样浓度增加顺序，按步骤3、4操作。 ５样品测定：取2 mL咖啡因饮料放入25mL容量瓶中（或取5mL茶叶放入50mL容量瓶中）分别用流动性稀释至刻度，过滤、脱气。按步骤3、4操作，分析饮料试液（咖啡或茶）。 五、数据处理 1）色谱图：由离线工作站读取保留时间、色谱峰面积Ａ理论塔板数 n、分离度R。根据标准试样色谱图中的保留数据，找到并标出咖啡或茶样色谱图中相应咖啡因的色谱图（定性）。 2）标准曲线1：以标准咖啡因浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，外标法定量，得线性方程为：A=( )C+( )；相关系数：r = 3）从曲线上求得咖啡因的含量。换算成饮料中咖啡因的含量。 4）将各组所测得样品浓度汇合，求平均值与标准差。 选择流动相时应注意的几个问题 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（如使固定液溶解流失等）。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 思考题 （1）解释色谱法测定咖啡因的理论基础。 （2）在本实验中，用峰高h为定量基础的校正曲线能否得到咖啡因的精确结果。 （3）能否用离子交换柱测定咖啡因？为什么？依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。 海南大学环境与植物保护学院 李培征