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DNA重组与基因工程 广州医学院实验医学研究中心 重组DNA技术 （recombinant DNA technique），在体外通过末端共价连接重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，使它们能在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。 遗传工程(Genetic engineering )就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。 遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程） 基因工程中最主要的工作是分子克隆（molecular cloning ） 基因重组所必需的元素及过程 1 目的基因 2 载体 3 工具酶 4 宿主细胞 载体分类 按功能 ①克隆载体（目的基因拷贝 ）； ②表达载体 （基因表达产物 ） 按宿主细胞 ①原核载体；②真核载体；③穿梭载体（携带两种宿主复制子，能在两种生物体内复制。） 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体 ①质粒（plasmid）细菌细胞基因组外的共价闭合环状双链DNA分子，能自主复制，能与细菌共生的遗传成分。 ②噬菌体（phage）感染细菌的一类病毒，有的基因组较大，例如λ噬菌和T等；有的则较小，如M13、f1、fd等。 ③动物病毒（virus）质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。 　①15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制 。 ③质粒对宿主生存并不是必需的 。 质粒载体的优缺点 ⑴优点——易操作，用途广 ⑵缺点——容量小，化学法的转化率低 ②噬菌体载体 双链DNA，滚环复制。 溶源性（温和phage ）——感染细菌后，整和到细菌染色体 溶菌性（烈性phage ）——感染后大量复制，细菌死亡破裂。 感染 溶源 条件诱导 溶菌 用作克隆载体的噬菌体 λ噬菌体和M13噬菌体 噬菌体载体的优缺点 ⑴优点——容量大，转染频率高，筛选方便 ⑵缺点——操作困难（需体外包装，CsCl2超速离心），保存困难（滴度下降） ③病毒载体 病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中，使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用的有改造来自猴肾病毒SV40（Simian Virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，其目的为将目的基因或序列导入动物细胞中表达进行功能研究或用作基因治疗等。 2. 工具酶 一般分四类： ①核酸酶（切割和裂解） ②连接酶 ③聚合酶 ④修饰酶 ①核酸酶 核酸酶可分为两类： 核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。 分类： 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ Ⅰ类限制性核酸内切酶　由3种不同亚基构成，兼有修饰酶活性，随机切割在识别位点1000bp以外的DNA序列。 Ⅱ类限制性核酸内切酶　只由一条肽链构成，切割DNA特异性最强，在识别位点范围内切断DNA。通常在重组DNA技术使用的限制性核酸内切酶 Ⅱ型酶的特点 ⑴识别序列 4-6碱基对，识别序列往往是旋转对称，迴文结构的双链DNA 5’…G↓AATT C …3’ 3’…C TTAA↑G… 5’ ⑵切割方式 平末端和粘末端 ⑶同裂酶 识别位点相同，切割位点不同或相同 ⑷同尾酶 来源不同，识别序列不同，但产生的粘性末端相同 星活性（star activity） ——非最适条件下酶的识别特异性降低，产生非特异的切割现象。 内切酶使用注意事项 ⑴选择正确的酶 ⑵酶的保存 50%甘油 -20℃，-70℃（长期保存） ②连接酶 T4连接酶的功能 催化双链DNA一端3’-OH与另一双链DNA的5’磷酸根形成3’，5’磷酸二酯键。 5’…CTGCAp　HOG…3’ 3’…GOH　pACGTC…5 5’…TCGp HOCGA…3’