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革 蘭 氏 染 色 及 簡 單 染 色 簡單染色 前 言 微生物體型很小，菌體多為透明無色，若將微生物製成懸浮液，至於顯微鏡時，通常僅能看見輪廓或細胞內較明顯的器官，不易與背景(水)有所區別，對微生物構造及特性的了解因此受到限制。 微生物染色原理主要是細胞表面或細胞內活化裝置(active site)與染料分子產生物理作用與化學反應。細胞中的蛋白質、核酸會分解氨基酸，並可在鹼性溶液中形成帶陰電的原子團與陽電荷納離子或鉀離子鹽類。此鹽類可與帶陽電荷的鹼性染劑(如：甲烯藍)產生離子交換現象： (Na)┼ (細胞蛋白質或核酸)─ + (甲烯藍)+(Cl)─ ↓離子交換作用 (甲烯藍)┼ (細胞蛋白質或核酸)─ + (Na)+(Cl)─ 微生物染色方法依微生物型態、特徵、細胞構造等目的的不同可分為簡單染色法與鑑別染色法兩大類。其中利用單一染料使微生物著色的方法即稱為簡單染色體法(簡稱單染法) 設 備 (一) 器 材 1. 載玻片 2. 接種環 3. 酒精燈 4. 塑膠滴管 5. 拭淨紙(吸水用) 6. 計時器 9. 燒杯(1000ml) 7. 洗滌瓶 (二) 儀 器 1.光學顯微鏡 (三)菌種 1.枯草桿菌(Bacillus subtilis) 2.大腸桿菌(Escherichia coli) 3.未知菌 4.口腔細胞 革 蘭 氏 染 色 前 言 此法使用一種以上的染劑進行染色，主要用來區別細胞間或細胞某部位的染色及鑑別菌體或菌體中的特殊部位。 常見得鑑別染色法：革蘭氏染色法(Gram stain)由於染色法簡單，判定容易，已成為實驗室鑑定未知菌中的必經手續，目前已知與環工有密切關係之微生物多為革蘭氏陰性菌。 染色步驟首先依單染法智作為生物細胞固定抹片，接著用四種溶液，結晶紫、碘液(媒染劑)、乙醇(脫色劑)及沙番紅分別處理，結果將微生物分成兩類，及革蘭氏陽性與革蘭氏陰性細菌。 凡是被乙醇脫色並接受番紅染色，使細菌成紅色反應者為革蘭氏陰性菌；若不被乙醇脫色仍保持結晶紫及碘所形成的複合物於細胞中呈紫色，則稱為革蘭氏陽性細菌。 設 備 (一) 器 材 1. 載玻片 2. 接種環 3. 酒精燈 4. 塑膠滴管 5. 拭淨紙(吸水用) 6. 計時器 9.燒杯(1000ml) 7. 洗滌瓶 (二) 儀 器 1.光學顯微鏡 (三)菌種 1.枯草桿菌(Bacillus subtilis) 2.大腸桿菌(Escherichia coli) 3.未知菌 實 驗 步 驟 一 : 簡單革蘭氏(Simple stain) 1. 使用之菌種為何? 2. 使用何種染劑? 3. 將菌液滴一滴於載玻片正中央，以另一載玻片之寬邊，將菌液均勻塗抹。 4. 以染劑染色，固定時間後沖洗掉染劑，沖洗時要注意以玻片背面沖洗，否則會將菌洗掉。 5. 觀察並繪下列結果 (a) 雙手拿取顯微鏡，並紀錄為哪種顯微鏡，哪種菌 (b) 以色筆描繪觀察之微生物 (c) 紀錄目鏡和物鏡之總放大倍率 (d) 微生物之大小測量(例如:長*寬各多長) (e) 由課本中尋找最接近之微生物，並記錄其學名 (f) 所繪之微生物不要僅用點或線段描述。例如下:(用些想像力) 革蘭氏染色操作步驟與反應結果 1.塗抹 從液體培養基取樣 ↓ 將一滴或二滴管之菌液置於在載玻片上 ↓ 以接種環將菌液均勻塗抹 2.乾燥 風乾—在室溫下讓此抹片自然乾燥 3.固定 固定—將抹片迅速通過火燄幾次 4染色 每步驟所應用的試劑 反應及細胞外觀 染色時間 格蘭氏陽性(G+) 格蘭氏陰性(G-) 1.結晶紫 細胞染成紫色 結 晶 紫 細 胞 細胞染成紫色 結 晶 紫 細 胞 60秒 2.碘液 在細胞內形成CV-I複合物，細胞殘留紫色 結晶紫 I2 細胞 在細胞內形成CV-I複合物，細胞殘留紫色 結晶紫 I2 細胞 60秒 3.乙醇 細胞壁脫水，發生多孔性收縮，降低CV-I滲出細胞，細胞呈紫色 結晶紫 I2 細胞 脂質從細胞壁被抽出，增加多孔性，而CV-I從細胞移出，呈現無色 細胞 30秒(本書建議20秒) 4.沙番紅 細胞不受影響 結晶紫 I2 細胞 發生染色而變粉紅色 沙番紅 細胞 30秒 5.吸乾水分之後鏡檢 以吸水