基于TALE的靶向基因修饰技术-方金辉要点.pptx

Precision genome engineering based on TALE 基于TALE的靶向基因修饰技术 硕生命1504 方金辉 2015.11.10 报告纲要 一、TALENs的研究背景 二、TALENs的原理 三、TALENs的操作要点 四、TALENs的应用 五、未解决的问题 1 报告纲要 一、TALENs的研究背景 二、TALENs的原理 三、TALENs的操作要点 四、TALENs的应用 五、未解决的问题 2 我们研究一个生物的性状，最终都需要做一件事：改变基因，从必要性和充分性两方面阐明基因功能。 1）Loss function：降低基因或删除基因 Give function: 提高基因的表达 一、TALENs的研究背景 3 生物学家的梦想：随心所欲地操作基因 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！ 经典基因操作： Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。 4.充满梦想却幻灭的ZFN： 难以完全找到匹配的3连子锌； Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 4 5 TALEN技术形成的关键研究 Sugisaki Hiroyuki Jens Boch 发现FokI核酸酶 破译TALE序列 （1981） （2009） Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。 (2011) TALE的发现迅速成为科技最前沿 报告纲要 一、TALENs的研究背景 二、TALENs的原理 三、TALENs的操作要点 四、TALENs的应用 五、未解决的问题 6 TALE蛋白中间含有一个重复区域，该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守，但第12位和13位的两个氨基酸可变，称为重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基，有如下一一对应关系： NG = T, HD = C, NI = A, NN = G or A ，NH=G 。 二、TALENs的原理 （重复可变双残基） RVD类型： TALE的结构 7 Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670 TALE的空间结构 8 2011年，把 C 端的转录激活子替换为 FokI 核酸内切酶，首次实现了 TALE 蛋白的人工改造，并显示具有良好的效果。 9 FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性，FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能： 10 11 TALENs ——识别任意特定核酸靶序列的重组核酸酶 构建TALE与核酸内切酶FokI的融合蛋白 FokI需形成二聚体才具有活性， 因此在目标DNA中选择两处靶序列，形成TALEN对 TALE是识别靶基因，FokI则起了切割DNA的作用 特异位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作 切割后（细胞 DNA 损伤后）会启动两种修复机制过程，一种为末端非同源依赖的修复机制 (NHEJ)，另一种是依赖同源重组的修复机制 (HDR)： 引入突变 造成基因敲进和修改 12 13 TALENs 靶向基因修饰的原理 14 基于TALEN的基因修饰 gene knock-out gene knock-in gene tagging nucleotide substitution protein truncation 报告纲要 一、TALENs的研究背景 二、TALENs的原理 三、TALENs的操作要点 四、TALENs的应用 五、未解决的问题 15 三、TALENs的操作要点 从选定的目标序列中寻找合适的 TALE 候选靶位点 ( 如果目的是突变基 因，一般选择比较靠前的外显子中的靶位点 )，选择