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业务专题报告(二) 对棉花育种分子标记实验的探讨 专业:农学专业 年级:农学09-(1)班 学生姓名:田景荣 利用分子标记技术对棉花群体后代遗传分析 摘要：以海岛棉和陆地棉杂交后代F5群体为研究材料，通过遗传分析和SSR分子标记探讨棉花长绒基因的遗传规律。结果表明，长绒棉纤维基因通过海岛棉和陆地棉多代回交，该基因的相关改性状在陆地棉品种上表现出来。陆地棉纤维长度接近海岛棉纤维。 关键词：SSR； 分子标记； 海岛棉； 陆地棉； 前言 棉花是世界上最重要的天然纤维物质，棉纤维是重要的纺织工业原料，绝大多数商品棉由四倍体栽种陆地棉和海岛棉生产，其中陆地棉占90%以上。随着纺织技术的改进及人民生活水平的提高，对棉纤维的品质要求越来越高。如何提高陆地棉产量同时，迅速改良棉纤维品质，培育出大面积播种的高品质棉花品种，是大多数棉花研究者的目标，也是广大人民的期望。 棉花的一些重要农艺性状如产量、品质等表现为数量遗传特点，不仅易受外界条件的影响，且还存在遗传负相关，因此常常导致选种工作量大、选择效率低（殷剑美，2002;郭旺珍和张天真，2003）【1-2】借助分子标记对目标性状的基因型进行选择减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的干扰，加速回交育种的进程，这是分子标记在棉花育种中应用的最主要方面（殷剑美，2002）。【3】 目前我国棉花纤维质量可以满足纺织工业纺中、低档棉纱的要求，但可纺高档棉纱的原棉纤维所占比例较少【4】】。中国棉花品质比较差，甚至与美国原棉品质有较大差距。万少安等认为这种认识上的偏差主要是我国原棉“同质性”、“一致性”差及商品棉品质下降引起的【5】。 本文通过对海岛棉与陆地棉杂交的第5代棉花作物群体进行SSR 多态性片段分子标记筛选结果进行相关的分析，研究长绒棉纤维基因是否从海岛棉转导到了陆地棉上面。 1 材料及方法 1．1材料 1.1.1 供试材料 陆地棉和海岛棉杂交后和陆地棉回交的后代群体 1.1.2 仪器设备及耗材 1）PCR扩增仪 2）高速冷冻离心机，最大离心力≥12000 rpm 3）电泳仪 4）短板垂直电泳槽及配套的灌胶附件 5）微量移液器：规格分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL 6）低温冰箱：最低温度-70℃ 7）高压灭菌锅：120℃，±2℃ 8）恒温水浴锅：温控精确度±1℃ 9）离心管 10）天平：分度值≤0.01 g 11）制冰机 1.1.3 试剂及溶液 1）液氮 2）无水乙醇 3）N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）。 4）四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），缩略为dNTPs 5）Taq DNA 聚合酶 6）1 moL/L Tris-HCL（PH 8.0）：称取Tris碱121 g，加800mL双蒸水溶解，用浓HCL调PH到8.0后，定容到1000 mL，灭菌，室温贮存 7）0.5 moL/L EDTA（PH 8.0）：称取EDTA 186.1 g，加800 mL双蒸水溶解， 用NaOH调PH到8.0后，定容到1000 mL，灭菌，室温贮存 8）乙醇：70%（V/V） 9）10%过硫酸铵溶液：10%（m/V）过硫酸铵，4℃，保存期7天 10）30%聚丙烯酰胺（交联度5%）：28.5 g的丙烯酰胺，1.5 g甲叉双丙烯酰胺， 加重蒸馏水60 mL，37℃溶解后定容至100mL。 11）5×Tris硼酸电泳缓冲液（5×TBE）：450 mmoL/L Tris-硼酸，10 mmoL/L EDTA （pH 8.0） 12）加样缓冲液A：80%（m/V）去离子甲酰胺，10 mmoL/L EDTA，1 mg/mL 溴酚兰，1 mg/mL二甲苯氰FF。 15）银染固定液：其中含10%（V/V）乙醇和0.5%（V/V）冰乙酸。 17）显影液：其中含1.5%（m/V）NaOH和0.4%（V/V）甲醛，即用即配。 19）DNA标准分子量标记。 20）染色液：0.2%AgNO3，即用即配。室温避光保存。 1.2 试验方法 1.2.1 棉花叶片的采集 采集BC5代棉花植株叶片进行检测，采取的时候尽量采上部的嫩叶。将采集的叶片用锡箔纸包好，做好标签，立即放入液氮罐中保存。 1.2.2 棉花总DNA的提取 孙志栋等【7】对提取棉花基因组DNA的CTAB法和SDS法及相应的改进进行的研究表明DNA的提取得率与提取方法和取材部位有关。叶磊等【8】为防止棉酚的氧化作用对棉花总DNA提取的方法进行了操作和试剂两方面的改进，从而使提取的DNA能很好地进行SSR-PCR的分析。 1）取0.1g叶片置于研钵中加液氮研磨粉末状装管（2.0mL EP） 2）加0.7μL DNA提取缓冲液1振荡混匀 12 00