制备多克隆抗体.doc

制备多克隆抗体的佐剂 ? ??? 如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔或山羊，在加用佐剂时一次注入量一般为0.5～1mg/kg。如不加佐剂，则抗原剂量应加大10～20倍。佐剂有福氏(Freund’s)佐剂、脂质体佐剂、氢氧化铝佐剂、明矾佐剂以及免疫刺激复合物(immune stimulating complex，ICOM)等。 ? ??? 其中最常用的是福氏佐剂，根据其组成分为完全福氏佐剂（CFA）和不完全福氏佐剂（IFA）两种。IFA通常由羊毛脂1份、石腊油5份组成，每毫升IFA中加入1～20mg卡介苗即为CFA。 制备多克隆抗体免疫动物的选择 ? ??? 由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体称之为多克隆抗体。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高，是其独特的优点。多克隆抗体的制备是一复杂的过程,为了制备高效价和高特异性的抗体，必须有理想的免疫原，挑选合适的动物和制定切实可行的免疫方案。 ? ??? 能作为免疫动物用的主要是哺乳类和禽类，其中常用的有家兔、绵羊、豚鼠和鸡，有时根据需要也可选用鼠、山羊和马等。选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体的选择等因素。如甾体激素多用家兔；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。体重为25g左右Balb/c小鼠。 制备多克隆抗体抗原的准备和免疫原的注射剂量 ? ??? 抗原的种类繁多，包括天然的蛋白质抗原和细胞性抗原、合成肽抗原以及基因工程抗原等，不同的抗原免疫动物动物具有不同的特殊性。一般的完全抗原免疫动物需加用佐剂，合成肽抗原和基因工程抗原等半抗原物质需先通过人工的方法与蛋白质载体连接后再与佐剂混合免疫动物，方可获得理想的免疫效果。 ? ?? 免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。对于细胞免疫的剂量，每次用于免疫羊的细胞数一般不低于1′108；免疫兔的细胞数不低于1′107；免疫小鼠的细胞数不低于1′106。为了增强免疫反应，可以将佐剂注射在接种抗原部位的附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。避免在细胞抗原中混合佐剂，以免破坏细胞，释放大量的胞质和胞核抗原，从而影响细胞膜抗原的免疫效果。对于纯可溶性抗原的免疫剂量，通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次；大鼠为100μg～200μg/次；兔为100μg～1mg/次，合成免疫原为2mg(半抗原约为20～200μg)，一般需要与等量福氏完全佐剂混合。加强免疫的剂量为首次剂量的1/2，通常用不完全福氏佐剂或不用佐剂。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。 抗体的三代制备技术 ? ??? 抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白，所以又称为免疫球蛋白(Ig)。特异性抗体是免疫应答中的重要产物，因此亦是免疫学实验中常用的试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学诊断和治疗中应用极为广泛。 ? ??? 传统的方法制备的抗体是用抗原免疫动物后所得，称为多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），也称第一代抗体； ? ??? 通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），也称第二代抗体； ? ??? 采用基因工程的手段研究抗体与功能的关系，并对抗体基因进行改造和重组等，由此制备出的基因工程抗体（genetic engineering antibody， GEAB），即为第三代抗体。 DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体 ? ?? ?该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。 ? ? ??1．批量提取法? 称取DEAE-纤维素(DE32或DE52)50g，置于1000ml烧杯中，先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干，或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤，收集湿纤维素，以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4吸附1h。上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便，既可小量提取，也可大量制备。 ? ??? 2．Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography) ? 　　【材料和试剂】 ?? （1）DE32或DE52纤维素。 ?? （2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.0