第五章抗体制药课题.ppt

三、毒素偶联的抗体药物 ⒈免疫毒素及其换代制品 在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。 第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。 ⒉免疫毒素的制备方法 ⑴毒素的来源 细菌毒素 植物毒素 ⑵载体的种类 ①小分子抗体FV或SCFV ②细胞生长因子 ③激素 ④CD4 ⑶制备方法 先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因，再与载体基因重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。 ⒊免疫毒素的临床应用 治疗肿瘤、自身免疫病 并能克复组织移植排斥反应，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。 初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 接头DNA VH VL 图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因III或基因VIII 外壳蛋白 VH VL 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 ⒈获取目的基因 ⒉抗体库技术的载体 ⒊淘筛 ⒋表达与鉴定 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 噬菌体cDNA展示技术的应用 1 用于模拟表位的研究。 2 用于DNA、RNA结合蛋白的研究。 3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。 4 用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研究。 5 细胞与蛋白相互作用的研究。 6 酶作用底物的分析、先导化合物的发现、定位信号转导途径等。 二、噬菌体抗体库技术的特点 ⒈模拟天然全套抗体库 ⒉避开了人工免疫和杂交瘤技术 ⒊可获得高亲和力的人源化抗体 该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 三、基因工程抗体表达 ⒈原核细胞表达 ⒉真核细胞表达 ⒊转基因植物表达 ⒋转基因动物表达 第六节 抗体诊断试剂 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 ⒈鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴常用诊断血清的品种和用途 ①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清 ⑵诊断血清的制备步骤 　①制备细菌抗原 　②免疫动物和制备抗体血清 ⑶诊断血清诊断方法 ⒉乙型肝炎病毒表面抗原的 反向被动血凝诊断试剂 ⒊妊娠诊断试剂 ⒋抗ABO血型系统血清 若将血型不相容 的两个人的血滴放在玻片上混合，其中的红细胞即聚集成簇，这种相容称为凝集（agglutination）