关于四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的表达.docVIP

关于四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的表达 　　多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fattyacids, PUFAs) 对人体具有独特的作用和意义，是一类被广泛研究和备受关注的脂肪酸。PUFAs包括omega;-3 和omega;-6 PUFAs 两种类型，每一种类型又包括多个碳链长度不同、不饱和键数量不等的成员。20C、22C 的多不饱和脂肪酸通常可称为长链多不饱和脂肪酸 (Long-chainpolyunsaturated fatty acids, LCPUFAs) 。DHA(22:6n-3)、EPA (20:5n-3) 和ARA (即花生四烯酸，20:4n-6) 是生物体内活性最强的3 种多不饱和脂肪酸，已经被证实在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。DHA 和ARA 已经被作为重要的营养补充剂广泛地添加到婴幼儿奶粉等食物中;EPA 又常称为血管清道夫，通常和DHA 一起食用，对心血管患者十分有益。现有的研究结果比较明确地证实了在哺乳动物体内DHA 的生物合成是从alpha;- 亚麻酸(18:3n-3) 开始的。首先是Delta;6-脂肪酸去饱和酶将其转变为18:4n-3，Delta;6-脂肪酸延长酶将其转变为20:4n-3，然后Delta;5-脂肪酸去饱和酶将其转变为EPA (20:5n-3)，并在Delta;5-脂肪酸延长酶作用下进一步延长为DPA (22:5n-3)。接下来DPA 转变成为DHA需要经历一个比较复杂而低效的过程，即所谓的“Sprecher pathway”：DPA 被进一步延长为24:5n-3，然后被Delta;6-脂肪酸去饱和酶将其转变为24:6n-3，然后经beta;-氧化后生成DHA(22:6n-3)。omega;-6 系多不饱和脂肪酸如ARA 的合成过程与此类似，使用相同的酶系。可见， 在多不饱和脂肪酸的合成过程中，Delta;6/Delta;5-脂肪酸去饱和酶和Delta;6/Delta;5-脂肪酸延长酶这4 种酶尤为重要。然而，研究表明哺乳动物中这些酶的效率是比较低的，例如alpha;-亚麻酸转变为DHA 的效率小于1%，亚油酸 (LA，18:2n-6)转变为ARA 仅为0.2%。因此，人体对更多的PUFAs 需求主要依靠从食物来源获取。在哺乳动物中为什么绝大部分的ALA 或LA 不能被转化为活性更强的长链多不饱和脂肪酸呢?很多学者对此进行了各种研究，但得出的结论并不完全令人信服甚至不同研究结论互相矛盾。我们设想，如果通过转基因方法提高多不饱和脂肪酸合成过程中关键性的几种酶活性，继而考察长链多不饱和脂肪酸的合成情况，可能会更好地解释这一疑问。本研究将来源人的Delta;6-脂肪酸去饱和酶基因fads2 和Delta;5-脂肪酸去饱和酶基因fads1 以及来源于小鼠的Delta;6-脂肪酸延长酶基因elovl5 和Delta;5-脂肪酸延长酶基因elovl2 这4 个多不饱和脂肪酸合成过程重要的基因在哺乳动物细胞(HEK293T) 中进行超表达，使其相应的酶活性增加，并在细胞的培养基中添加LA 和ALA 两种脂肪酸底物，经过一定作用时间后收集细胞并提取脂肪酸，利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 分析脂肪酸的组成和变化情况，从而探讨哺乳动物细胞中多不饱和脂肪酸的合成的一些深层次问题。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　大肠杆菌DH5alpha;、质粒pcDNA3.1(-)为本实验室保存。HEK293T 细胞购于中国协和医科大学细胞库。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、总RNA 提取试剂RNAiso plus、RT-PCR 试剂盒等购于宝生物工程 (大连) 有限公司。质粒提取试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒等购于天根生化科技 (北京) 有限公司。转染试剂LipofectamineTM2000 为Invitrogen 公司产品。细胞培养所用培养基、血清、培养皿等为Hyclone产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因表达载体的构建来 源 于 人 的Delta;6- 脂肪酸去饱和酶基因(fads2，编码445 个氨基酸) 和Delta;5-脂肪酸去饱和酶基因 (fads1，编码448 个氨基酸) 以及来源于小鼠的Delta;6-脂肪酸延长酶基因 (elovl5，编码300 个氨基酸) 和Delta;5- 脂肪酸延长酶基因(elovl2，编码297 个氨基酸) 这4 个基因的多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2 以串联独立表达的方式构建在pcDNA3.1 质粒上，每个目的基因各自有独立的启动子和终止信号polyA，故能独立表达不相互影响