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剖析重组2 型腺相关病毒肿瘤坏死因子的质量 　　一直以来恶性肿瘤的治疗方法均是基础及应用研究聚焦的重点，放疗、化疗和手术治疗三大传统的治疗方法均有其不可忽视的局限性。因此，寻找具有生物活性的特异性的细胞毒性分子，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，已成为当今肿瘤生物治疗领域的一个研究方向。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-induced Ligand，TRAIL)又称凋亡素2 配体(Apo2 ligand，Apo-2L)，是可诱导肿瘤细胞凋亡的肿瘤坏死因子家族成员，其最大的特点是可选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒副作用。TRAIL 有5 种受体，分别为死亡受体4(death receptor 4，DR4)、死亡受体5(DR5)、诱骗受体1(decoy receptor 1，DcR1)、诱骗受体2(DcR2)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)，5 种受体的同源性较高，均可与TRAIL 发生特异性结合而不与其他配体结合。目前，国内已有数家企业开展针对TRAIL的重组蛋白药物和基因治疗制剂的研发。与重组蛋白药物相比，基因治疗的主要优势在于外源基因的稳定持续表达。本实验的研究对象为重组2 型腺相关病毒TRAIL(recombinant adeno-associated virus 2 encodingTRAIL，rAAV2-TRAIL)，该制剂是将携带TRAIL 的质粒转染BHK-21 细胞，然后在辅助病毒1 型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1，HSV1)的作用下包装获得。为保证该类制剂的安全、有效和质量可控，本实验依据《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010 版)相关要求，结合该产品的特点，针对其结构、表达量、生物学活性、病毒颗粒数等关键质量属性开展研究，建立相应的质控方法，为质量标准的拟定提供数据支持。 　　1 材料与方法 　　1. 1 供试品及对照品 　　rAAV2-TRAIL 基因治疗制剂、理化对照品均由委托质量研究的生产单位提供。 　　1. 2 细胞、病毒及质粒 　　293T 细胞、神经胶质瘤U251细胞和腺病毒(Ad5)均来自ATCC;阳性标准质粒pAM / CAG-TRAIL-neo、pSub201 和pHyTK(均按照1 times; 109 copies / mu;l 冻存备用)由委托质量研究的生产单位提供。 　　1. 3 主要试剂及仪器 　　PBS(pH 7. 4)、0. 25%胰酶、MEM-EBSS 培养基、DMEM 培养基、胎牛血清和青链霉素均购自美国Gibco 公司;CCK-8 染色试剂购自日本同仁化学研究所;DMSO、蛋白酶K、酚、氯仿等化学试剂购自美国Sigma 公司;TRAIL 蛋白浓度测定ELISA 试剂盒购自美国Ramp;D 公司;3 mol / L NaAc及PCR 相关试剂购自日本TaKaRa 公司;SpectraMAX 250 型酶标仪及分析软件由美国MolecularDevices 公司提供;7500Fast 实时荧光定量PCR 仪、9700PCR 仪由美国ABI 提供。 　　1. 4 重组基因结构的鉴定 　　根据供试品基因组DNA的结构特性，采用PCR 法分别对启动子CAG 和插入的目的基因TRAIL 进行分析。将供试品煮沸10 min后，冰上冷却2 ~ 3 min，作为PCR 模板。CAG 鉴别：上游引物：5prime;-TGA CGT CAA TGG GTG GAG TA-3prime;，下游引物：5prime;-ATG GGG AGA GTG AAG CAG AA-3prime;，扩增片段大小为230 bp;反应条件为：94 ℃变性5 min;94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环;72 ℃延伸7 min。TRAIL 鉴别：上游引物：5prime;-ATG GCC CTG TGG ATG CGC CTC-3prime;，下游引物：5prime;-TTA GCC AAC TAA AAA GGC C-3prime;，扩增片段大小为650 bp;反应条件同上。引物由Invitrogen 公司合成。PCR 产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以灭菌纯水代替模板同步反应作为阴性对照，同时将理化对照品与待测样品同步处理作对照。 　　1. 5 目的蛋白TRAIL 表达量的检测 　　取对数生长期的293T 细胞，用含10% FBS 的DMEM 完全培养液制备细胞悬液，每孔按2 times; 105 个/ 2 ml 接种6 孔板，37 ℃， 5% CO2