快速膜乳化与热固化法制备粒径均一聚糖季铵盐凝胶微球.docVIP

快速膜乳化与热固化法制备粒径均一聚糖季铵盐凝胶微球 　　1 前 言 　　近年来，生物可降解高分子微球在生物医药领域的应用受到广泛关注. 作为药物载体，微球具有保护药物活性、拓展给药途径、缓控释给药等优点. 生物可降解高分子微球常用的基质材料有聚乳酸、聚碳酯、多糖等. 壳聚糖作为一种天然无毒的氨基多糖，用其制备的微球可作为蛋白质、多肽、疫苗、DNA、抗癌及抗炎等药物的载体. 与其他材料所制微球相比，壳聚糖微球具有良好的生物粘附性，能粘附在粘膜表面，延长微球及所载药物在粘膜处的停留时间，有利于提高药物的生物利用度，能暂时打开上皮细胞间的紧密连接，促进药物吸收，具有免疫增强和免疫调节作用，可作为疫苗佐剂. 目前壳聚糖微球制备方法主要分为化学和物理交联法. 前者制备包埋蛋白质、多肽等药物的壳聚糖微球时，由于蛋白质及多肽上常带有氨基，因此戊二醛在与壳聚糖反应的同时，还可能与包埋药物发生反应，造成药物活性降低及释放不完全等;微球中残留的化学交联剂还会与体内的蛋白、酶等发生反应，降低微球的生物安全性，所制微球不具有pH 敏感性，无法用作 pH 响应性药物载体，限制了其应用. 　　物理交联法缺点在于体系为水相溶液，微球固化过程中药物易泄露到外水相，导致药物包埋率低. 壳聚糖仅溶于酸性溶液，而绝大多数蛋白质、多肽等药物在酸性环境下易失活. 两种方法均采用机械搅拌、超声、均质等分散方法，导致所制液滴不均一，微球粒径均一性差，影响后续应用. 壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠混合体系的pH 为中性，且在低温(4℃)环境中可长期保持溶液状态，升温(37℃)后转变为凝胶态. 以该体系为水相，结合常规膜乳化技术制备均一乳液，升温自固化后得到了粒径 10 ?m以上的壳聚糖季铵盐微球，避免了弱酸环境和化学交联剂对药物的不利影响. 但由于体系粘度较大，难用常规膜乳化技术制备小粒径(lt;10 ?m)微球. 而小粒径微球在生物医药领域有重要用途，如作为肿瘤靶向药物载体和疫苗佐剂，小粒径微球比大粒径微球有更大优势. 高粘度体系采用快速膜乳化技术有望制备小粒径微球此外，快速膜乳化法乳液过膜速度快，可降低高粘度体系在微孔膜上的残留，提高微球的均一性和产率. 本研究采用快速膜乳化与热固化法，以壳聚糖季铵盐/甘油磷酸钠(HTCC/GP)混合体系为水相，制备了粒径均一、pH 敏感的壳聚糖季铵盐凝胶微球，考察了跨膜压力、油相组成、水相组成、油水比等对微球粒径、药物包埋与释放的影响及壳聚糖季铵盐凝胶微球的细胞毒性及 pH 敏感性，探讨其作为 pH 响应性药物载体的可能性 　　2 实 验 　　2.1 材料与试剂 ?-?-甘油磷酸钠(?-?-Glycerophosphate, ?-?-GP，药用级，山西运城风陵渡开元药化有限公司)，壳聚糖季铵 盐 {N-[(2-hydroxy?3- trimethylammonium) propyl] Chitosan Chloride, HTCC，季铵取代度 40%，按文献[24]方法自制}，聚甘油脂肪酸酯类混合乳化剂 PO-500 (Polyglycerol fatty acid ester，食品级，日本 SakamotoYakuhin Kogyo 公司)，CCK8(Cell counting kit-8)试剂盒(日本同仁化学有限公司)，牛血清白蛋白(BSA，纯度ge;98%，美国 Roche 公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(美国Pierce公司)，青霉素、链霉素、10%胎牛血清及DMEM细胞培养基均购自美国 Gibico 公司，巨噬细胞系J774A.1(北京大学医学部)，液体石蜡(Liquid Paraffin, LP)、石油醚(Petroleum Ether, PE)、乳酸、乙醇均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司. 　　2.2 实验装置与分析仪器 FMEM-500M 快速膜乳化装置与微孔膜[中科森辉微球技术(苏州)有限公司]，BS 110S 型电子天平(德国Sartorius 公司)，RCT basic 磁力搅拌器(德国 IKA 公司)，T18 均质乳化机(德国 IKA 公司)，3K30 高速离心机(美国Sigma公司)，Zetasizer Nano ZS动态光散射粒度仪(英国 Malvern Instruments 公司)，K850超临界干燥仪(南京覃思科技有限公司)，OCA 20 接触角测定仪(德国Dataphysics 公司)，JFC-1600 真空离子溅射机(日本 JEOL公司)，JSM-6700F 冷场发射扫描电子显微镜(SEM，日本 JEOL公司)，Infinite M2000 酶标仪(瑞士 Tecan 公司). 　　3 结果与讨论 　　3.1 HTCC 凝胶微球