构建肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z1445 缺失的基因.docVIP

构建肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z1445 缺失的基因 　　肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157∶H7可引起人出血性结肠炎(hemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等。在O157∶H7 中，z1445 是功能未被注释的基因。我们欲研究z1445 基因的功能，首先通过Red重组系统敲除z1445 基因。Red系统是在大肠杆菌lambda;噬菌体中存在的一种区别于宿主的重组系统，该系统由exo、bet、gam 等3个基因组成。exo 基因编码外切核酸酶，能降解双链DNA的5#39;端链，产生突出的3#39;端;bet 基因编码的beta;蛋白能结合单链DNA，防止DNA被核酸酶降解，并启动互补链的退火和交换反应;gam 基因的编码产物能与宿主的RecBCD蛋白结合，抑制RecBCD 蛋白降解线性双链DNA 分子。该系统通过促进外源DNA与染色体DNA重组，将目的基因替换，从而达到敲除目的基因的目的。我们借助于Red系统将O157∶H7中的z1445 基因置换为卡那霉素抗性基因(kan)，并进一步依靠FRT位点将kan 基因去除，从而获得z1445 基因被精确敲除且不带kan 基因的O157∶H7突变株。 　　1 材料及方法 　　1.1 材料 　　EHEC O157∶H7 菌株EDL933，质粒pKD46、pCP20由本室保存;插入kan 基因的质粒pUC19-kan由本室构建;大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞、BL21(DE3)表达感受态细胞，pEASY-T1 simple载体，高保真TransStart Taq DNA聚合酶，DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司;基因组提取试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB 公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒，质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;2 mm电击杯购自Bio-Rad公司;氨苄西林、卡那霉素、L-阿拉伯糖购自Sigma公司;PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 　　1.2 pUC19-z1445Up-kan-z1445Down质粒的构建 　　取5 mL过夜培养的O157∶H7 EDL933，用基因组提取试剂盒提取其基因组;查找GenBank公布的z1445 基因序列，根据其上、下游各500 bp的序列，用Primer 5.0软件设计PCR引物。以获得的基因组为模板，用引物Up F、Up R扩增z1445 基因上游的同源臂序列500 bp，用引物Down F、Down R扩增z1445 基因下游的同源臂序列500 bp。反应体系：双蒸水37.5 mu;L、缓冲液5 mu;L、dNTP 4 mu;L、F及R引物各1 mu;L、基因组模板1 mu;L、Easy Taq DNA聚合酶0.5 mu;L。反应条件：95℃预变性10 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环;72℃终延伸10 min;4℃冷却。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Easypure PCR产物纯化试剂盒回收纯化，送苏州金唯智生物科技有限公司测序。回收产物与克隆载体pEASY-T1 simple连接，转化大肠杆菌DH5alpha; 感受态细胞，提取质粒和pUC19-kan 载体同时进行双酶切(上游为HindⅢ、SalⅠ，下游为BamHⅠ、EcoRⅠ)，上、下游同源臂分别连接于pUC19-kan 载体的两侧，构建打靶片段pUC19-z1445Up-kan-z1445Down(以下简称pUC19-UKD);提取重组质粒，以重组质粒为模板，用引物Up F、Down R 扩增UKD 打靶片段，鉴定正确的UKD打靶片段经DpnⅠ内切酶处理，用于切除来自细菌的模板质粒，最后纯化回收线性打靶片段备用。 　　1.3 电转感受态细胞的制备与同源片段的重组 　　于5 mL LB培养基中按1∶100的比例接入大肠杆菌BL21(DE3)，37℃、200 r/min振荡培养过夜，次日按1∶100的比例转接到10 mL LB培养基中继续培养，待菌液D600nm达0.3时，添加L-阿拉伯糖至终浓度为20 mmol/L，振荡培养75 min，至D600nm 约为0.7时取出，冰上放置10 min，4℃、5000 r/m离心2 min收集菌体，用冰冷的ddH2O 洗菌体3 次，用冰冷的1