Rubisco活性的测定inbook植物生理学实验手册.docVIP

4-17 二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)羧化活性的测定 核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶 (EC 4.1.1.39) 是光合作用中的一个关键酶，它在Calvin循环中催化CO2的固定，生成二分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA),同时它是一个双功能酶，又能催化将O2加在核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)的C-2位置上生成一分子的磷酸乙醇酸和一分子的3-磷酸甘油酸，这两个反应的速率由O2和CO2浓度调节。 Rubisco羧化活性的测定一般通过测定从NaH14CO3生成酸稳定的[1-14C]-3-PGA的速率来进行, 也可以用酶偶联法将3-PGA的变化转变为NADH来测定。其原理如下： RuBP + CO2 + H2O Rubisco+Mg2+ 2 ×3-磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸 + ATP 3-磷酸甘油酸激酶 + Mg2+ 1,3-二磷酸甘油酸 + ADP 1,3-二磷酸甘油酸 + NADH 3-磷酸甘油醛脱氢酶 3-磷酸甘油醛 + NAD+ + H+ + PO4-3 从以上反应计算一分子RuBP的羧化就有两分子的NADH被氧化，这样就可以用紫外分光光度计在340 nm测NADH的减少来计算酶活力。 1仪器设备 液体闪烁计数器、烘箱、水浴锅、研钵或组织捣碎机、分光光度计等 2 操作方法 2.1 Rubisco的提取及纯化 2.1.1 植物粗提液的制备 称约X g叶片加入X ml预冷到4℃提取缓冲液 (Tris-HCl pH 7.8 100 mmol/L, KCl 20 mmol/L, EDTA 1 mmol/L)中匀浆，15000g离心10 min取上清液备用。 2.1.2 酶的纯化 将上述得到的粗提液用40%饱和度的硫酸铵进行分部，8000 g, 在4℃冷冻离心20min。然后取上清液加硫酸铵至70%的饱和度，10000g，冷冻离心20 min后取沉淀，用少量重悬缓冲液 (25 mmol/LTris-HCl pH7.8, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 巯基乙醇，20 mmol/L KCl)溶解，再经Sephadex G-25脱盐后上DEAE (DE52)柱，用含0-0.5 mol/L NaCl的重悬缓冲液进行梯度洗脱，收集0.25 mol/L NaCl分部。70%硫酸铵沉淀保存于 -20℃，待测活性前以2 mg/ml溶于重悬缓冲液中备用。 2.2 同位素测定法 2.2.2酶活性的测定操作 在460μl测定反应液(Tris-HCl pH8.2 100 mmol/L, NaH14CO3 ( 0.2 μCi/μmol) 10 mmol/L，MgCl2 20 mmol/L，DTT 1 mmol/L)中，加入20 μl酶液 (2 mg/ml)，混匀后在25℃保温10-20 min， 加入20μl RuBP储存液 (10 mmol/L pH 6.5) 起始反应，0.5-1 min后加入200 μl的HCl (2 mol/L) 终止反应。取500 μl在闪烁计数杯中烘干以去除CO2，最后加入0.5 ml水和4.5 ml闪烁液(PPO 8.5 g，POPOP 0.5 g，TritonX-100 0.5 l，甲苯 1.0 l)，进行液闪计数。 活力计算方法如下： 羧化酶活力(μmol/min/mg 蛋白) ( 14 C (dpm)/(dpm 14C/μmol CO2)/时间(min)/蛋白量(mg) 2.2.3 初始活性和总活性的测定Rubisco在体内的含量很高，但它的活性很低，许多实验表明这是由于体内的酶只有一部分是活化的。可用下面的图来表示Rubisco活化过程： 钝 化 活 化 ER R E CM (ECM) R (ECM)R C (ECM)RC (ECM) + P R = RuBP C = CO2 M = Mg2+ P = 产物 Rubisco在体内的活化状态与植物的生理状态有很大的关系，它的活化状态可用活化率来表示。Rubisco的活化率为其初始活性除以总活性再乘以100。 (1) 初始活性的测定 将20μl 植物材料初提液直接加到480μl 的反应液（内含0.4 mmol/L RuBP)中。在25℃保温0.5-1 min后，加200μl HCl (2 mol/L) 终止反应。以下步骤及活性计算与上所述相同。 (2) 总活性的测定 将20μl 植物材料粗提液加入460μl 反应液中，在25℃保温10 ~ 20 min充分激活后, 加入20μl RuBP 后起始反应。0.5-1 min后用HCl 终止反应。以下步骤与初始活性的测定相同。 (3) Rubisco活化率计算 Rubisco活化率 ＝初始活性