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浅析肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制.docVIP

浅析肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制.doc

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浅析肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制

浅析肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制   肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一种重要的抗纤维化因子,具有抗肝纤维化作用。近年来研究显示:HGF也有抗肾纤维化作用,但其抗肾间质纤维化的作用机制目前尚不完全清楚。近年来研究表明:HGF可通过抗肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(tubularepithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)而防止肾脏纤维化,TEMT 被认为是导致肾间质纤维化的重要原因。近期研究发现:血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ,AngⅡ)也是很强的致TEMT因子,且HGF与血管紧张素转化酶抑制剂联合有更好抗的TEMT作用,但关于HGF和AngⅡ对TEMT的影响及是否存在相关性尚无确切报道,本课题组主要针对HGF和AngⅡ与TEMT的关系进行深入研究。   1 材料与方法   1.1 细胞和主要试剂   人肾近曲小管上皮细胞(human kidney proximaltubular cells-2,HK-2)购自中国生命科学院上海细胞库。RPMI-1640和胎牛血清(美国Gibco 公司),CK-8 试剂盒和BCA 蛋白定量试剂盒(碧云天生物有限公司),alpha;-平滑肌肌动蛋白(alpha;-SMA)抗体及二抗(美国Santa Cruz),RT-PCR 试剂盒(日本Takara公司)。   1.2 HK-2细胞培养   HK-2细胞用含有10%RPMI-1640胎牛血清的培养液培养。在含10% 胎牛血清100U·mL-1青霉素和100mg·L-1链霉素的RPMI-1640培养基中传代培养。将HK-2细胞按1times;106 接种在75cm2 Flask培养瓶中,培养条件为37℃、5%CO2,当贴壁细胞达80%~90%融合时用无血清培养基洗3次,进行传代或种板,取Ⅳ期细胞进行实验。   1.3 细胞分组及CCK8法检测   以每孔1times;103 细胞接种于96孔板中,接种后6h加入刺激物,按加入刺激物的不同将HK-2细胞分对照组、AngⅡ组、HGF组和AngⅡ+HGF组,每组3复孔。对照组只加HK-2细胞,HGF和AngⅡ组在细胞的基础上分别加入8 mu;g· L-1 HGF 和1 times;10-6 mol·L-1 AngⅡ,AngⅡ+HGF组在细胞基础上同时加8mu;g·L-1 HGF和1times;10-6 mol·L-1AngⅡ。24h后收集细胞,每孔加入10mu;L CCK8,37℃孵育1h后,检测450nm 处吸光度(A)值。以A值表示细胞增殖活性。   1.4 RT-PCR法检测HK-2细胞中alpha;-SMA mRNA表达水平   采用Trizol法提取总RNA,检测mRNA 浓度,逆转录合成cDNA。PCR 扩增alpha;-SMA基因,beta;-actin为内参。alpha;-SMA,正义链5prime;-ACTGGGACGACTAGGAAAAAG-3prime;, 反义链5prime;-CATCTCCAGAGTCCAGCACA-3prime;。beta;-actin,正义链5prime;-ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC-3prime;,反义链5prime;-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3prime;。PCR扩增体系:cDNA 模板2mu;L,去离子水14.5mu;L,10 times; PCR 缓冲液2.5 mu;L,dNTP(2.5mmol·L-1)2mu;L,MgCl2 (25mmol·L-1)1.5mu;L,上游引物(50mu;mol·L-1)1mu;L,下游引物(50mu;mol·L-1)1mu;L,ExTaqDNA 聚合酶(5U·mu;L-1)0.5mu;L,总体积25mu;L。PCR扩增反应条件:94℃、5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸1min,共30个循环;72℃延伸5min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用Phoretix ID凝胶图像分析软件测定电泳条带的灰度值,用内参校准,以alpha;-SMA/beta;-actin灰度值比值表示alpha;-SMA mRNA表达水平。   1.5 Western blotting法检测HK-2细胞中alpha;-SMA蛋白表达水平   将细胞加入细胞裂解缓冲液,离心,提取总蛋白。取总蛋白50mu;g作SDS电泳,凝胶浓度为10%,浓缩胶电压110V,电泳30min,分离胶电压100V,电泳90min。电泳结束后,用电转印仪将蛋白转移到PVDF膜上,时间60m

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