研究氟尿嘧啶在小鼠结肠癌模型中抗肿瘤的效应.docVIP

研究氟尿嘧啶在小鼠结肠癌模型中抗肿瘤的效应 　　结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤，其发病率为20.9/10万，位于恶性肿瘤的第6位，而居城市人群恶性肿瘤发病的第2位。对于中晚期结肠癌患者，手术后的化疗对巩固手术疗效提高生存率显得尤为重要。目前，以氟尿嘧啶(5-FU)为主的多药联合应用在临床已广泛应用，但如何提高5-FU疗效的同时减少药物的用量及其副作用是目前有待解决的关键问题。随着免疫细胞生物学、免疫学和分子生物学的飞快发展，免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗后辅助治疗的重要手段。本研究旨在探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine　inducedkiller　cells，CIK)联合化疗药物5-FU 对结肠癌细胞的杀伤活性， 为结肠癌的综合治疗提供理论依据。 　　1　材料与方法 　　1.1　主要试剂和材料 　　BALB/C小鼠(扬州大学动物中心);C26原代肿瘤细胞株(广州细胞库，本室传代培养); 重组小鼠IL-1alpha;(rmIL-1alpha;)、IL-2(rmIL-2)(RD 公司); 重组小鼠IFN-gamma;(rmIFN-gamma;)、CD3(145-2C11)单克隆抗体(Bio　legend 公司);抗小鼠CD45PE　Cy5/IgG2bPE-Cy5、CD80FITC/IgG2b-FITC、CD86PE　Cy7/IgG2alpha;PE-Cy7和CTLA-4PE/IgM-PE(eBioscience公司);Trizol(Invitrogen 公司)，Taqman 定量PCR 试剂盒(ABI公司);5-FU 购自江苏南通精华制药有限公司;Applied　Biosystems　7500(ABI公司);流式细胞仪(Beckman　Coulter公司)。 　　1.2　实验方法 　　1.2.1　小鼠CIK细胞制备　无菌状态下取出BALB/c小鼠脾脏，研磨后收集脾细胞悬液，置于无血清RPMI　1640培养基中，离心收集脾单个核细胞，用含10%胎牛血清的RPMI　1640完全培养基调整细胞浓度为1times;106/ml，接种于24孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。第0天加入IFN-gamma;(1000 U/ml)、anti-CD3 McAb (1mu;g/m1)、anti-CD28McAb(1mu;g/m1)、mIL-2(300U/ml)、mIL-1alpha;(100U/ml)。以后视生长情况扩孔，调整细胞浓度在(1.5times;106～2.0times;106)/ml和半量更换含mIL-2(300U/ml)新鲜RPMI　1640完全培养基，最后收集的细胞为小鼠CIK细胞，同时经流式细胞学鉴定。 　　1.2.2　小鼠皮下结肠癌模型的建立和分组　剃除BALB/c小鼠背部毛，取处于对数生长期的C26结肠癌细胞5times;105，用0.2ml的无菌PBS混悬，接种与小鼠背部皮下，每3天测量小鼠肿瘤体积，当体积均达到约150mm3 时用于实验。取40只荷瘤鼠随机分成四组，每组10只。设A 组(正常对照组)：NS(0.2ml，d　0)+ NS(0.2ml，d　3);B组(5-FU组)：5-FU(12.5mg/kg，d　0)+NS(0.2ml，d　3);C组(CIK 组)：NS(0.2ml，d　0)+CIK细胞(1times;107，d　3);D组(5-FU+ CIK组)：5-FU(12.5mg/kg，d　0)+CIK 细胞(1times;107，d　3)。5-FU 采用腹腔注射当天给药; CIK 细胞(约1times;107)制成生理盐水悬液0.2ml，第3天一次性经尾静脉缓慢输注给药。 　　1.2.3　记录小鼠肿瘤生长情况及生存期　用游标卡尺每隔3天测量各组小鼠肿瘤的最大径(a)与垂直直径(b)，利用公式V=ab2/2计算肿瘤体积，观察每组荷瘤小鼠的生存期。当肿瘤出现溃疡或肿瘤长径超过20mm做为小鼠死亡标志。 　　1.2.4　流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞CTLA-4和非淋巴细胞CD80、CD86表达　正常对照组和5-FU 组中小鼠经相应治疗后第10天随机抽取5只处死，分离瘤体，剪碎，取其中部分组织采用机械法分离单细胞悬液后行流式细胞学检查(其余部分组织用于抽提总RNA行RT-PCR)，首先以CD45/SSC圈门，分析CD45+ 细胞的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic　T　lymphocyteassociated　antigen-4， CTLA-4)和CD45-细胞CD80、CD86的表达。 　　1.2.5　RNA提取及RT-PCR检测肿瘤组织IFN-gamma;和TNF-alpha;　四个治疗组中小鼠